年产5000吨糖化酶发酵车间设计

菌中，构建了糖化酶高产工程菌[7,8]．近几年来，罗进贤等人将酵母Ty转座子的8序列，黑曲霉糖化酶Edna及C,418抗性基因tie重组进酵母整和型质粒Yiplae128获得含LEU2，tie双标记基因，糖化酶Edna的高整和型表达载体YI128D．17N，转化cRF18(YI128D．17N)糖化酶基因在该菌株获得高效表达，产物分泌到胞外．吴晓萍等人“ 将切除了5’端非编码区50碱基对片段的黑曲霉糖化酶GA I Edna与大麦a 一淀粉酶基因重组进埃希大肠杆菌一酵母穿梭载体，构建重组表达质粒pMAG11，转化酿酒酵母GRF18，获得含a一淀粉酶和糖化酶双基因的酵母工程菌GRF18(magi)，在酵母PGK基因启动子和终止信号的调控下，a一淀粉酶和糖化酶基因获得高效表达，99％ 的表达产物分泌至胞外．糖化酶的基因的研究对黑曲霉糖化酶基因的研究有了不断的进展，尤其是对其结构基因和调控序列．主要研究不同真菌中糖化酶的基因克隆、表达和糖化酶的性质，在挖掘糖化酶资源方面做了大量工作[9,10]．

虽然对糖化酶的研究已有多年，但是仍有许多问题尚待进一步探索．基础研究领域将主要集中在糖化酶的结构研究，如糖链在糖化酶活性、稳定性及构象状态中所起的作用，进一步阐明糖化酶的多型性原因及糖化酶的热稳定性机制

[11]

．应用研究之一仍将是进一步提高糖化酶的活力，利用诱变、DNA重组技术或

其他方法获得优良菌株，提高糖化酶基因在受体菌中的表达水平等，进一步优化糖化酶纯化工艺及保存条件；另一方面，诱变筛选耐热糖化酶产生菌或克隆耐热糖化酶基因，将是一个重要方向，因为耐热糖化酶在发酵业的应用将会大大降低能源消耗，从而降低生产成本，将给糖化酶在工业中的应用开辟更为广阔的前景

1.4 设计内容及意义

酶制剂是一种生态型高效催化剂，具有高效、安全、节能、生态和环保等特点，能够有效带动相关领域技术水平的提高，对应用产业开发新产品，提高质量、节能降耗、保护环境具有重要意义，产生了巨大的社会效益和经济效益。酶制剂产业已经成为生物技术领域的前卫产业和21世纪最有希望的新兴产业之一。国家十一五期间已将酶制剂列为重点发展的领域，将投资几十亿到该产业，建立生产、研发、出口、检测、菌种保藏基地，使中国成为世界酶制剂生产基地和研发基地，引领世界酶制剂市场.

而酶制剂中的糖化酶主要应用领域为酒精、白酒、淀粉糖、味精等行业，目前我国酒精年生产能力为897万吨，年需万单位糖化酶242000吨，白酒企业年需糖化酶20000吨，淀粉糖和味精企业需求25000吨左右，而国内现有企业糖化酶产量才207000吨，远远不能满足市场需求。但是酒精企业的扩建，造成粮食短期供应紧张，酒精企业有297万吨产量未能达产，少消耗糖化酶80000吨，因此缓解了市场供求矛盾。随着世界能源的日趋紧张，世界各国都在大力发展可再生能

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年产5000吨糖化酶发酵车间设计

源，因此，以后糖化酶的生产将会有很大的空间[12]。

本设计以玉米淀粉为主要原料，利用黑曲霉，采用机械搅拌通风罐进行发酵生产，完成年产5000吨糖化酶发酵车间工艺设计，通过工艺流程设计、工艺衡算、设备选型和车间布置设计，设计出年产5000吨糖化酶发酵车间，并依据生物工程工厂车间布置原则，对发酵罐车间进行合理布置，绘制了工艺流程图和车间布置图，工艺设计的结果为糖化酶的生产提供一定参考。

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年产5000吨糖化酶发酵车间设计

2 本论

2.1 糖化酶生产中所用黑曲霉的特性

黑曲霉在液体培养基中32℃摇瓶培养96h，粗提酶液经进一步分离提取，得到同时具有液化和糖化两种酶活力的新型酶制剂，最适PH值为4．6。耐酸性α—淀粉酶活性的最适温度为60℃，糖化酶活性的最适温度为50℃。在pH4．6酸性条件下，该液化糖化酶在50℃保温1h，仍具有原酶活性。黑曲霉广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。有的菌株还可将羟基孕甾酮转化为雄烯。生长适温37℃，最低相对湿度为88%，能引致水分较高的粮食霉变和其他工业器材霉变。

2.2菌种培养工艺

糖化酶发酵罐中必须用纯培养接物种，并且接种量要求相当大，目的是使发酵迅速安全地进行，因此生产上需要有菌种扩大培养的操作。扩大培养可按下述步骤进行：

试管原种→10mL.试管→500 mol三角瓶→1-2L三角瓶→10-20L罐→100-200L罐→1000-2000L罐。 2.2.1 菌种活化

将保存的原菌种先转接到10mL 10°Box麦芽汁的试管中，在34℃下培养24h。这时可以看到培养液混浊，镜检观察有无杂菌污染。此时的检查十分重要。这将是关系到整批发酵成功的关键。可适当转接多次。 2.2.2 一级种子培养

将上述的培养的种子液转移接入一级种子罐中。培养液的的组成为（g/l）： 培养基在100Kpa表压下灭菌30min。在34℃下培养5-6天。

玉米粉60； 玉米浆20； 黄豆粉20； KNO3 3; MgSO4*7H2O 1.2; KH2PO4 2.7; PH自然 2.2.3 二级种子培养

将上述一级种子罐培养出来的种子液接入装有更多培养液的二级种子罐中，在100Kpa表压下灭菌15min,煮沸灭菌后立即冷却至培养温度在34℃左右，培养7-10天。培养时观察到整个表面孢子着色均匀，显出成熟特征的颜色即可。

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后续每一步培养液的量扩大10～15倍，在30～34℃下培养。

一般工厂中，菌种的扩大培养只是生产开始时进行一次，而正常生产中采用连续法接种，即将一部分旺盛的发酵液作为接种物，接入新配好的培养液中进行发酵。只有在发现发酵异常、菌种不纯或退化、影响生产时，才重新开始扩大培养一次。

2.3 工艺计算

2.3.1工艺技术指标及基础数据 （1）.工艺技术指标及基础数据

表2—1 黑曲霉产糖化酶发酵工厂技术指标 指标系数 生产规模 生产方法

单位 t/a

指标数 指标系数 5000

发酵辅助时间 菌种培养时间 菌种培养辅助时间 接种量 发酵罐装料系数 放罐发酵单位 提取总收率

单位 h h h % % u/ml %

指标数 24 24 15 10 80 12000 80

液体深层发酵

300 15625 20000 2 120

年生产天数 d/a 产品日产量 Kg/d 产品质量 倒灌率 发酵周期

u/ml % h

( 2 ) 种子培养基(g/l):玉米粉60；玉米浆20；黄豆粉20；KNO3 3;MgSO4*7H2O 1.2;KH2PO4 2.7;PH自然

（3）发酵初始培养基（g/l）：玉米粉50；玉米浆20；黄豆粉20；麸皮30；料：水=1：7，接种量10% （4）采用间歇发酵培养 2.3.2发酵工艺流程图：

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