蛋白表达纯化实验步骤(待改进)

1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。

2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。

3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.

4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。

5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。

6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、

Bl21 codon(DE3)等。

7、蛋白的诱导表达。

1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM

到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。

2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体

蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。

3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。

甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。

4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),

诱导过夜作为包涵体检测样品。

注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2.

保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。

8、包涵体检测。方案见附件2

9、如有上清表达,则扩大摇菌。

1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种

的活性而异,也可过夜摇菌。

2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约

2.5h~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。)注:菌液浓度要适当

的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。

拿起锥形瓶对光摇动,看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是,将手指放在瓶底晃动,看不清手指为宜,不过此法宜受气泡影响。

3)过夜摇菌,使用包涵体检测的温度(18°左右),转速140rpm左右。

4)将菌液6000rpm,4min,4度离心收集菌体。加入20mM PBS,洗一遍后用平衡缓

冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液,视菌液的浓度而定。可用4支50ml的离心管同时离心,但是,离心管要重复使用,用完后洗净保存。

10、超声波裂解。

1)用6mm变幅杆,35%功率,3.5s工作,7s休息,50min即可。

注意:1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部,尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。

4.正常声音为:孜孜声,尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头

松动等原因,要及时调整。溶液由浑浊变清透,由粘稠变不粘稠表明裂解完成(后面3000转离心时,如果沉淀少说明裂解的好)。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min(即关闭总电源开关)。

注意:1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解,在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂(PMSF),PMSF工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全,就按上述条件裂解

60分钟,60分钟足够裂解。

11、取得上清

1)将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。10000rpm,15min,4°离心。沉淀为包涵

体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻轻的将上清倒出,尽量不要倒出沉淀。(此时可以测量一下pH值,pH值最好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8左右,裂解后上清就会在7.5左右。)

12、纯化上清---摸洗脱条件。

1)镍柱处理。将1ml镍柱吸入空层析管中,待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。

2)将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上,并将过柱的样品重复上样3次。(若是流

速慢可以在柱子下面加一个针头,或者用1ml的枪将胶体吹散。)取20μl过柱后的样品,以备跑胶。

3)分别加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。每个梯度分别

的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中,以备跑胶。

注意:理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度,直到吸光度为零时再进行下一个梯度的洗脱。实际上测不到零,怎么都会有一点的,上面说的量已经做够洗脱了。

4)加Elution Buffer 将目的蛋白洗脱。上样量为4.5ml(将前面的0.5ml单独接入EP

管,再将后面的4ml接入另外两个EP管),留跑胶样品。

5)加MES将NI柱重生。MES加10ml,流完后再加10ml Miliq H2O。流完后保存于2

倍体积的20%乙醇中,镍柱至少能重复利用6次。(尿素可能对NI柱有损伤。)注意:所有溶液使用前都要确定其pH是否正确,pH对挂柱及洗脱影响较大。镍柱所用溶液MES的ph=5.0,其余Equilibration Buffer pH=7.8 ,上清pH=7.5 ,Wash Buffer pH=7.0 ,Elution Buffer pH=7.2。

13、跑胶验证。

1)跑2块0.75mm的PAGE胶,把所有的样品都加上去,注意两块胶的浓分离比要相

同两块胶才会比较一致。

2)跑胶顺序:负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、

W7、W8、W9、E1、E2、MES

3)300V快速压胶5min左右,160V分离样品50min左右。(也可以300V,30min,只是

图没有160V好看。)

4)考马斯亮蓝染色。一般染色2h即可。

5)脱色。先用脱色剂1脱15min,再用脱色剂2脱过夜。