7）文库的鉴定、收集、保存； 确定文库大小的方法：

以在构建的基因组文库中任一基因存在的概率来衡量文库的质量或完备性，它与基因文库最低所含克隆数N（即文库大小）之间的关系可用下式表示： N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ) 其中：

N：文库所需的总克隆数；

P：任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率； f：克隆片段的平均大小/ 生物基因组的大小。 9. 基因文库的类型包括哪两种？各有什么特点？

10. 一般质粒DNA的构型有哪几种？在琼脂糖凝胶电泳中的有何特点？ 超螺旋质粒DNA、开环质粒DNA、线状质粒DNA

在琼脂糖凝胶电泳的特点是：电泳的泳动速度由大到小分别是： 超螺旋质粒DNA>线状质粒DNA>开环质粒DNA

11. 碱裂解法提取质粒DNA的原理，分析影响试验结果的各种可能因素。 碱裂解法原理：在碱性条件下，双连DNA氢键断裂，结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除去。

（各种可能因素是上一届的，具体其实大家可以根据那天师兄说的去写） 提取失败：1）洗去双链时，将质粒DNA洗去； 2）破壁失败，质粒没析出； 3）加剂问题

电泳失败：1）电压太高 2）没加染色剂 3）胶穿孔 4）电泳时间过长

12. 电泳缓冲液使用一定时间后出现DNA在凝胶中跑不动现象的原因，有何解决办法？

原因：电泳缓冲液的离子的富集作用； 解决方法：1.更换成新配置的电泳缓冲液； 2.把电泳槽中的缓冲液倒出混匀后再重新使用

13. 电泳的指示剂和染色剂有何区别，各自的作用是什么？

指示剂一定要在电泳前加入，指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液；（一般为：溴酚兰，二甲苯青）

作用：①预知电泳的速率及方向；②使样品呈现颜色，便于加样； ③一些高浓度蔗糖或其它物质增加DNA的密度，可以防止DNA的扩散

染色剂即可以在电泳前加入样液，又可以电泳后再对凝胶染色；（溴化已锭[EB]、硝酸银、Goldview染料） 作用：呈现出核酸电泳后的带型。 第三章 基因克隆的酶学基础

1、 限制性核酸内切酶的类型，基因工程常用的是哪种限制性核酸内切酶？（常用II型）

2、 什么是星活性，产生星活性的因素可能有哪些？

在非最适合的条件下酶的识别特异性降低，产生非特异性带，这种活性称星活性。 产生Star活性的因素：（书上P46-P47答案）

高浓度甘油，碱性pH，存在Mn2 ，低离子强度，低盐浓度，低pH

3、 结合已做的实验，分析影响酶切的因素。（这个答案是上届的，仅供参考） 1）DNA的纯度：DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。

2）DNA的甲基化程度 ：dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。

3）温度 ：不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。4）缓冲液(Buffer)：是影响限制酶活性的重要因素。

MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2 和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）： 保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等： 有助于酶的稳定； β－巯基乙醇： 保持酶的稳定性，防止酶失活 4、 限制性核酸内切酶命名规则及各字母代表的含义。（例子和图帮助大家理

解而已）

命名规则：寄主菌属名的第1个字母＋种名的前两个字母＋菌株或菌型代号（大写）＋空白＋发现序列（罗马数字）

例子：EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序) 5、 简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。

同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。

同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶

（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。）

6、 连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？

类型：DNA连接酶和RNA连接酶 异同点：

相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。 不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。

影响因素：（影响因素就四个，后面分析觉得烦的话大家自己看着办啦） 1）连接所用的目的片段的状态： 1 效率：粘性末端>平端(100倍)； 1 5，突出>3，突出；

1平端：HaeIII>AluI>HinCII>SmaI 2）连接温度

1连接效果最好在37 ℃，但形成的互补不稳定;

1最佳连接温度：12-16 ℃，较好的连接效果，互补又较稳定; 3）反应液中的成分：

1 ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，连接缓冲液宜分装； 1单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果； 1 PEG：5%以下可以提高连接效率 4）插入片段与载体的浓度比例

1载体DNA与外源DNA的分子摩尔比通常为1﹕3左右，甚至1﹕10 或更高。 1目的或作用：增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。 7、 试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。（传说中的网上答案） 1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。

2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。 3、足够多的载体和插入片段是最重要的 。 4、平端的连接对于离子浓度很敏感 5、尽可能缩小连接反应的体积

6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好 8、 基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？ 1）大肠杆菌DNA聚合酶 2）Klenow fragment 3）T7 DNA聚合酶 4）T4 DNA聚合酶

5）修饰过的T7 DNA聚合酶 6）逆转录酶

7）Taq DNA聚合酶

第四章 基因克隆的载体系统

1、 作为基因工程载体，其应具备哪些条件？ ! 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）； ! 具有合适的筛选标记；

! 具有较高的外源DNA的载装能力； ! 具有多克隆位点（MCS）；

! 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 2、 质粒的不相容性及其分子机理。

● 定义：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。

● 分子机理：两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制同时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。

3、 载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？

基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 4、 质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？

A、 化学法（CaCl2法)转化原理：是Ca2 与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内（感受态细胞）。

B、电穿孔转化转化原理：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场，在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。 影响转化率的主要影响因素:

1）载体本身的性质及其空间构象：超螺旋构象转化率最高； 2）插入片段的大小：插入片段越大，转化效率越低；