实验一 叶绿体的分离与荧光观察

1．实验目的

了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。 2．实验原理

叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。将匀浆液在1000r/min离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，3000r/min离心，可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。在室温下进行分离要迅速。

某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。 3．实验材料、用品

⑴ 实验材料：菠菜叶片

⑵ 实验药品：蒸馏水，0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙。

⑶ 实验仪器：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，接种针，目镜测微尺，物镜测微尺，恒温箱，培养皿，滤纸，试管，试管架，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管。 4．实验步骤

⑴ 选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于0.35mol/L氯化钠溶液15ml中臵组织捣碎机或研钵中。

⑵ 利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆，3~5min，或研磨成匀浆。 ⑶ 用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。

⑷ 取滤液4ml在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。

⑸ 将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。

⑹ 沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。

⑺ 取叶绿体悬液1滴臵于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察。使用荧光显微镜观察时，将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片后即可观察。

⑻ 观察叶绿体的形态结构、测量1-5个叶绿体的长轴和短轴、叶绿体发射荧光的现象。 5．实验报告

⑴ 观察叶绿体的形态结构,测量5~10个叶绿体的长轴和短轴求其平均值。 ⑵ 记录荧光显微镜下观察的叶绿体自发荧光和次生荧光现象，分析结果。 6．思考题

1

⑴ 分离叶绿体实验的原理是什么？操作过程中应注意什么？ ⑵ 普通光学显微镜和荧光显微镜的原理有何异同点？

2

实验二 线粒体和液泡系的超活染色与观察

活体染色是能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品又没有毒害作用的一种活体染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。

通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的“电化学”特性。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活体染色，理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。一般说来，最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(Janus green B)和中性红(neutral red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色分别具有专一性。 1．实 验 目 的

⑴ 观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布； ⑵ 学习一些细胞器的超活染色技术。 2．实 验 原 理

线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。

中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔基体)的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。

3．实 验 用 品 ⑴ 器材

显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、解剖盘．载玻片、凹面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。 ⑵ 试剂

① Ringer溶液：

氯化钠 0.85g (变温动物用0.65g) 氯化钾 0.25g 氯化钙 0.03g 蒸馏水 100ml

② 10%、1/3000中性红溶液： 称取0.5g中性红溶于50ml Ringer液，稍加热 (30-40℃)使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。 ③ 1%、1/5000詹纳斯绿B溶液

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