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（2）Hargrove法(调整特异度)

中点公式：I?回顾公式：I?R??P?100%

(R/2)?N(w/365)??N??(P/2)R??P?100%

R?N(w/365)??T变量符号：①待计算的变量值：I＝新发感染率（高危人群中每100人年新感染的数量），F＝调整灵敏度或特异度的调整因子；②在横断面调查中测量的变量值：T＝调查的总人数，P＝HIV-1 检测为阳性的总人数，N＝HIV-1检测为阴性的总人数，R＝实验判定为新近感染的总人数；③从单独的校准研究中获得的变量值：w＝窗口期（从血清阳转到实验方法能够判为新发感染的最长时间），α＝实验方法检测新发感染(＜1w)的灵敏度，β＝实验方法对感染时间在1w-2w天样品的特异度，γ＝实验方法对感染时间超过2w天样品的特异度，ε＝实验方法对感染时间超过2w天样品的误判率。

我国BED方法HIV-1新发感染相关的校正系数值是基于分析来自1565个已知血清阳转日期（大约）样品的BED检测值，这些值为：w =168天，α=0.8098，β=0.7571，γ=0.9315，ε=0.0685

6质量控制 6.1人员培训

进行新发感染检测的实验人员必须经过严格的技术培训，而且在正式开展新发感染检测工作之前，至少要做5次预实验，除阴性对照外，其他样本ODn值的CV值均需小于15%。必须参加能力验证，如结果不合格，需仔细分析原因，纠正后方可继续开展检测。 6.2样品质控

所有样品的采集、运输、检测及保存必须严格按照本规范执行。样

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品检测之前要核对正确，并完全融化，充分混匀。稀释样品以及将稀释好的样品加入酶标板时，必须使用带滤芯的枪头，避免交叉污染。 6.3试剂质控 6.3.1 试剂内对照

每个试剂盒内均含有厂家提供的阴性、低值阳性、高值阳性和校准品，用于判断每次实验的有效性，要求每次实验的OD和ODn值均需在要求范围内，否则结果视为无效，必须重新进行检测。每次检测样品时，必须有试剂盒内部对照，而且只能应用在同批号的试剂盒中，并对内部对照建立Levey-Jennings质控图，以保证检测的准确性和精确性。 6.3.2 试剂外质控

新发感染试剂必须按照要求运输和保存。采购后，需进行平行实验验证，确保符合质量要求之后，才可进行实验。每次实验须同时做外部对照，如外部对照不通过须重新实验。此外，开启试剂盒时，需在包装盒上注明开启日期，同时注意在有效期内使用，避免使用临近有效期的试剂。

6.4实验过程质控

实验过程中，环境条件（主要指室温）要恒定（15-30℃）。严格按照试剂盒说明书操作，控制每一步骤的孵育时间和温度。时间应准确计量，禁止估算。必须定时维护和校准仪器设备，尤其是加样器、孵育箱，以保证结果准确性。保留所有的原始实验记录，并有检测人以及复核人的签字。如果初筛实验和确认实验同一份样本的ODn值相差较远，一致性较差，需要3孔复检，做第三次检测，以两次相关性较好的结果为最终结果。

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第四章 HIV-1抗原检测

1 范围

本章规定了HIV-1p24抗原检测的方法和用途。适用于对人血液样品和病毒培养上清液中HIV-1p24抗原的检测。

2 规范性文件引用

NIAIDVirology

Manual

for

HIV

Laboratory,

NIH

Publication,No.97-3828, Jan 1997.

Niel Constantine，HIV Viral Antigen Assays, HIV InSite KnowledgeBaseChapter,September 2001, http://hivinsite.ucsf.edu

3 HIV－1p24抗原检测的意义

3.1 HIV-1感染窗口期、HIV-1抗体不确定或HIV-1阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断。

3.2 第四代HIV检测试剂（抗原抗体检测试剂）的阳性结果的辅助诊断。 3.3 HIV-1分离培养、病毒复制状况的监测。

4 实验室要求 同HIV抗体检测。

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5 检测方法及程序

5.1 试剂：原理一般是抗体夹心法，包括酶联免疫吸附试验（ELISA法）、酶联荧光分析法（ELFA）、电化学发光法（ECLIA）、抗原抗体快速检测法等。应使用经国家药品监督管理总局批准注册的试剂。 5.2 样品：血清、血浆、全血或病毒培养上清液。 5.3 定性检测 5.3.1 筛查试验

酶联免疫吸附实验（ELISA法）：抗体包被固相反应孔（管）的底部，待测样本中P24抗原与包被抗体形成抗原抗体复合物，再加入酶（HRP）标记的HIV-1抗体与抗原结合，加底物显色，在酶标仪上读取结果。

酶联荧光分析法（ELFA）：待测样品的p24抗原与包被在固相孔（管）内的p24抗体结合，并被生物素标记的p24抗体识别。经过碱性磷酸酶复合物孵育后加底物，酶复合物催化底物水解成荧光产物，此荧光可在450nm波长处检测。对每份标本的固相孔（管）测量两次，第一次是加入底物前的背景读数，第二次是酶复合物催化底物水解后的读数。仪器自动分析计算相对荧光值（RFV）并自动报告判读结果。

电化学发光法（ECLIA）：待测样品的p24抗原与包被抗体的磁性微粒和发光剂标记的抗体在反应管中温育，形成磁性微珠包被抗体-抗原-发光剂标记抗体复合物。将复合物吸入流动室用TPA（tripropylamine 三丙胺）缓冲液冲洗，流经电极表面时，结合了的磁性微珠被电极下的磁铁吸附，而游离的磁性微珠及发光剂标记抗体被冲走。同时在电极加电压，启动电化学发光反应，使发光试剂标记物和TPA在电极表面进行电

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子转移，产生电化学发光。仪器根据发光值（COI）判读结果。

抗原抗体快速检测法：待检样本中的HIV抗体、HIV-1 p24抗原分别与样品垫中的HIV-1/HIV-2抗原、HIV-1 p24单克隆抗体结合形成复合物，在毛细作用下沿着硝酸纤维膜向上移动，至相关抗体、抗原包被区域后，分别与之结合，组成有色复合物线条。质控线用于检测过程质量控制，肉眼判读检测结果。

筛选试验依据试剂盒说明书提供的标准判断有反应或无反应。 5.3.2 中和试验

中和试验主要是p24抗原检测的补充试验，还可做HIV-1RNA的定性或定量检测，以排除筛查试验的假阳性。

中和试验：

（1） 酶联免疫吸附实验（ELISA法）：待检样品先与中和剂（p24 抗原的抗体）共同孵育，如果样品中存在p24抗原，中和抗体将与之结合形成复合物，而不能与固相载体上的捕获抗体结合。之后，用这样处理过的样品重复筛查实验，同时做一孔未中和的原始样品对照，将中和与未中和孔的OD值进行比较，如果中和孔的OD值下降50%以上，认为样品中的p24 抗原是真阳性；如果中和孔没有出现OD值的下降或下降的幅度不到50%，认为筛选试验p24抗原的反应性可能是假阳性，需要做RNA检测或随访做进一步确证。

（2）酶联荧光分析法（ELFA）：原理和检测步骤同上述酶联免疫吸附实验（ELISA法）。结果判断方法为，比较中和与未中和样品的荧光值（RFV），根据说明书提供的方法计算中和率，如果中和率大于或等于

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