食品化学实验指导书(第二版) 下载本文

准确称取65.4三氯醋酸,以蒸馏水溶解定溶至1000 ml (6)0.5 mol/L的NaOH:

准确称取2 g NaOH溶解并定至100 ml (7)10.00 mg/ml酪素溶液

称取酪素1.000 g,准确至0.001 g。用少量的0.5 mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿,加入适量的各适宜的缓冲液约80 mL,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100 mL容量瓶中,用适宜的缓冲液稀释至刻,此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天。 (8)100μg/ml酪氨酸标准溶液

a、准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L的盐酸60ml 溶解后定容至100ml,即为1.00mg/ml的酪氨酸溶液.

b、吸取1.00mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml,用0.1mol/L盐酸定容至100ml,即得100.0μg/ml L-酪氨酸标准溶液. (9)酶样的制备

准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样,用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上清液倒入100ml容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。滤液可作为测试酶用.该酶已经稀释100倍。 2.仪器和设备

分析天平:精度0.0001 g 恒温水浴:精度±0.2℃ 计时表 分光光度计 沸水浴器 振荡混合器

pH计: 精度0.01pH单位 四、实验步骤

(1)标准曲线的绘制 L-酪氨酸标准溶液按下表配制。

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试管号

取 100 μ g/ml 酪氨溶液( ml )

蒸馏水( ml ) 酪氨酸实际浓度(μ g/ml )

0 0 10 0

1 1 9 10

2 2 8 20

3 3 7 30

4 4 6 40

5 5 5 50

(2)分别取上述溶液各1.00 mL(须做平行试验),各加0.4 mol/L碳酸钠溶液5.00 mL。福林试剂使用溶液1.00 mL,置于40+0.2℃水浴中显色20 min,取出用分光光度计于波长680 nm,比色,以不含酪氨酸的0管为空白管调零点,分别测定其吸光度值,以吸光度值为纵坐标,酪氨酸的浓度为横坐标,绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量(μg),即为吸光常数K值,其K值应在95~100范围内。

(3)样品测定:

a) 先将酪素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中,预热5 min b) 取4支试管,各加入1 mL酶液

c) 取一支作为空白管,加2 mL三氯乙酸,其他3管作为测试管各加入1 mL酪素,摇匀,40℃保温10 min

d) 取出试管,3支测试管中各加入2 mL三氯乙酸,空白管中加1 mL酪素。 e) 静置10 min,过滤沉淀

f) 各取1 mL滤液,分别加0.4 mol/L的 Na2CO3 5mL、福林试剂1 mL。在40℃显色20 min。680 nm处测OD值。 以空白管调零点。

注:1.398中性蛋白酶制剂和166中性蛋白酸制剂,除反应与显色温度为30℃±0.2℃外,其他操作同上,标准曲线做同样处理。 五、计算

计算酶的活力依据以下公式

蛋白酶的活力= A×K×4/10×n U/g(mL)

A:样品平行试验的平均OD值 K:吸光常数 4:反应试剂的总体积 10:酶解反应时间 n:酶液稀释总倍数

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(二) 紫外法测定蛋白酶活力

一、实验目的

掌握一种蛋白酶活力的测定原理和方法;学习一种酶活的计算方法。 二、实验原理

蛋白酶在一定的温度与pH条件下,水解酪素底物,然后加入三氯乙酸终止酶反应,并使未水解的酪素沉淀除去,滤液对紫外光有吸收,可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位的定义:在40℃(酸性pH=3.0、中性pH=7.5、碱性pH=10.5)条件下,1 min水解酪素产生1 μg酪氨酸的酶活为一个酶活力单位,以u表示。 三、实验材料和仪器 1.试剂

(1)三氯乙酸c(CCl3·COOH)=0.4 mol/L

称取三氯乙酸65.4 g,用水溶解并定容至1000 mL。 (2)氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5 mol/L

按GB601配制。

(3)盐酸溶液c(HCl)=1 mol/L及0.1 mol/L

1 mol/L HCl:取90 mL浓盐酸溶解于去离子水中,定容至1000 mL。 0.1 mol/L HCl:取9 mL浓盐酸溶解于去离子水中,定容至1000 mL。 (4)缓冲溶液

a、磷酸缓冲液(pH=7.5)适用于中性蛋白酶

称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02 g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·12H2O)0.5 g,加水溶解并定容至1000 mL。

b、乳酸缓冲液(pH=3.0)适用于酸性蛋白酶

甲液:称取乳酸(80%~90%)10.6 g,加水溶解并定容至1000 mL。 乙液:称取乳酸钠(70%)16 g,加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液:取甲液8 mL,加乙液1 mL,混匀,稀释一倍,即成0.05 mol/L乳酸缓冲溶液。

c、硼酸缓冲溶液(pH=10.5)适用于碱性蛋白酶

甲液:称取硼酸钠(硼砂)19.08 g,加水溶解并定容至1000 mL。

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乙液:称取氢氧化钠4.0 g,加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液:取甲液500 mL、乙液400 mL混匀,用水稀释至1000 mL。 上述各种缓冲溶液,均须用pH计校正。 (5)10g/L酪素溶液

称取酪素1.000 g,精确至0.001 g,用少量0.5 mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2~3滴)湿润后,加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL,在沸水浴中边加热边搅拌,直到完全溶解,冷却后,转入100 mL容量瓶中,用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天。 (6)100 ug/mL-酪氨酸标准溶液

a、称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000 g,精确至0.0002 g,用1 mol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL,即为1 mg/mL酪氨酸标准溶液。

b、吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL,用0.1 mol/L盐酸定容至100 mL,即得到100ug/ mL L-酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 2.仪器和设备

恒温水浴40±0.2℃;紫外分光光度计(应符合GB 9721的规定)。 三、实验步骤 1.求K值

按下表配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液,然后,直接用紫外分光光度计于275 nm测定其吸光度(A),以吸光度A为纵坐标,酪氨酸的浓度c为横坐标,绘制标准曲线(此线应通过零点), 根据作图或用回归方程,计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(μg),即为吸光常数K值;(其K值应在(130~135)范围内)。

管 号 酪氨酸标准溶液的浓度 (μg/mL) 0 10 20 30 40 50 取100 ug/mL酪氨酸标准溶液的体积 mL 0 1 2 3 4 5 取水的体积 mL 10 9 8 7 6 5 吸光值 Abs. 0 1 2 3 4 5

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