准确称取65.4三氯醋酸,以蒸馏水溶解定溶至1000 ml （6）0.5 mol/L的NaOH：

准确称取2 g NaOH溶解并定至100 ml （7）10.00 mg/ml酪素溶液

称取酪素1.000 g,准确至0.001 g。用少量的0.5 mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿，加入适量的各适宜的缓冲液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的缓冲液稀释至刻，此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 （8）100μg/ml酪氨酸标准溶液

a、准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L的盐酸60ml 溶解后定容至100ml,即为1.00mg/ml的酪氨酸溶液.

b、吸取1.00mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml,用0.1mol/L盐酸定容至100ml,即得100.0μg/ml L-酪氨酸标准溶液. (9)酶样的制备

准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上清液倒入100ml容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。滤液可作为测试酶用.该酶已经稀释100倍。 2．仪器和设备

分析天平：精度0.0001 g 恒温水浴：精度±0.2℃ 计时表 分光光度计 沸水浴器 振荡混合器

pH计: 精度0.01pH单位 四、实验步骤

（1）标准曲线的绘制 L-酪氨酸标准溶液按下表配制。

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试管号

取 100 μ g/ml 酪氨溶液（ ml ）

蒸馏水（ ml ） 酪氨酸实际浓度（μ g/ml ）

0 0 10 0

1 1 9 10

2 2 8 20

3 3 7 30

4 4 6 40

5 5 5 50

（2）分别取上述溶液各1.00 mL(须做平行试验)，各加0.4 mol/L碳酸钠溶液5.00 mL。福林试剂使用溶液1.00 mL，置于40+0.2℃水浴中显色20 min，取出用分光光度计于波长680 nm，比色，以不含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值，其K值应在95~100范围内。

（3）样品测定：

a) 先将酪素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5 min b) 取4支试管，各加入1 mL酶液

c) 取一支作为空白管，加2 mL三氯乙酸，其他3管作为测试管各加入1 mL酪素，摇匀，40℃保温10 min

d) 取出试管，3支测试管中各加入2 mL三氯乙酸，空白管中加1 mL酪素。 e) 静置10 min，过滤沉淀

f) 各取1 mL滤液，分别加0.4 mol/L的 Na2CO3 5mL、福林试剂1 mL。在40℃显色20 min。680 nm处测OD值。 以空白管调零点。

注：1.398中性蛋白酶制剂和166中性蛋白酸制剂，除反应与显色温度为30℃±0.2℃外，其他操作同上，标准曲线做同样处理。 五、计算

计算酶的活力依据以下公式

蛋白酶的活力= A×K×4/10×n U/g(mL)

A：样品平行试验的平均OD值 K：吸光常数 4：反应试剂的总体积 10：酶解反应时间 n：酶液稀释总倍数

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（二） 紫外法测定蛋白酶活力

一、实验目的

掌握一种蛋白酶活力的测定原理和方法；学习一种酶活的计算方法。 二、实验原理

蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位的定义：在40℃（酸性pH=3.0、中性pH=7.5、碱性pH=10.5）条件下，1 min水解酪素产生1 μg酪氨酸的酶活为一个酶活力单位，以u表示。 三、实验材料和仪器 1．试剂

（1）三氯乙酸c（CCl3·COOH）=0.4 mol/L

称取三氯乙酸65.4 g，用水溶解并定容至1000 mL。 （2）氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5 mol/L

按GB601配制。

（3）盐酸溶液c（HCl）＝1 mol/L及0.1 mol/L

1 mol/L HＣl：取90 mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000 mL。 0.1 mol/L HＣl：取9 mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000 mL。 （4）缓冲溶液

a、磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶

称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02 g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5 g，加水溶解并定容至1000 mL。

b、乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶

甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6 g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液：称取乳酸钠（70％）16 g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液：取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05 mol/L乳酸缓冲溶液。

c、硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶

甲液：称取硼酸钠（硼砂）19.08 g，加水溶解并定容至1000 mL。

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乙液：称取氢氧化钠4.0 g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液：取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000 mL。 上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。 （5）10g/L酪素溶液

称取酪素1.000 g，精确至0.001 g，用少量0.5 mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 （6）100 ug/mL－酪氨酸标准溶液

a、称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000 g，精确至0.0002 g，用1 mol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL，即为1 mg/mL酪氨酸标准溶液。

b、吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1 mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 2．仪器和设备

恒温水浴40±0.2℃；紫外分光光度计（应符合GB 9721的规定）。 三、实验步骤 1．求K值

按下表配制不同浓度的L－酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计于275 nm测定其吸光度（A），以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）, 根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值;（其K值应在（130～135）范围内）。

管 号 酪氨酸标准溶液的浓度 （μg/mL） 0 10 20 30 40 50 取100 ug/mL酪氨酸标准溶液的体积 mL 0 1 2 3 4 5 取水的体积 mL 10 9 8 7 6 5 吸光值 Abs. 0 1 2 3 4 5

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