流式细胞仪常用的几种检测方法 下载本文

精品文档,放心下载,放心阅读

流式细胞仪常用的几种检测方法(转载)

一、测定用乙醇固定的DNA的含量

1、培养细胞的DNA含量的测定精品文档,超值下载

1) 4) 2 1)

制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中;

加入2ml预冷的70%乙醇,4℃保存;

附:细胞固定的一般步骤

取单细胞悬液1~2×106个细胞于PBS(PH=7.2)缓冲液中;

2) 300g离心5分钟,弃上清,反复两次; 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中;

将细胞悬液放置于2~3ml冷70%乙醇中,混匀,保存于4℃,至少30分

钟。在4℃条件下可保存2~3周。

注意:

2 根据实验的要求,固定剂也可选用1~3%多聚甲醛; 2 将乙醇作为固定剂时,乙醇应预冷至0~4℃;

细胞在固定时,固定剂应缓慢滴入细胞悬液中,使固定剂的浓度缓慢增加,

并不断震摇,以免细胞成团(特别是用乙醇固定时)。 2 300g离心5分钟,去上清,再重悬于400μl PBS中; 2 显微镜下观察,若有明显的黏附,须再用筛网过滤;

2 加入PI(含Rnase),避光孵育30分钟;

2 上机检测。 2、新鲜组织的DNA含量的测定

1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液;

2) 500g离心5分钟;

3) 弃上清,重悬于10ml染色-去污剂中; 4) 再过滤,用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤;

5) 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定

从石蜡包埋切取切片50 μm厚,2~3片,制成单细胞悬液;

2) 用PBS缓冲液洗涤,500g离心5分钟,弃上清;

3) 加入PI液1ml室温避光30分钟; 4) 调整细胞浓度为1×106/ml;

5) 上机检测。

二、细胞凋亡检测及相关分子检测

1、细胞DNA含量分布(由细胞DNA降解方式检测细胞凋亡) 2 收集已固定的单细胞悬液约5×105~1×106/ml;

2 离心除去固定液,3ml PBS重悬细胞; 2 1500rpm离心,5分钟 ,弃去PBS; 2 加PI染液1ml,室温避光20分钟;

2 调整细胞浓度5×105/ml;

2 上机检测。

2、磷脂酰丝氨酸外翻分析检测细胞凋亡

1) 常规制备单细胞悬液,用PBS洗两次.(若为全血要先

溶 血),取约5×106个细胞,1500rpm

离心,弃上清,用400μl 1×Binding Buffer重悬;

2) 分成a、b、c、d、e五管,每管约1×106个细胞

a) 阴性对照,不加任何试剂;

b) 阳性对照,加2%多聚甲醛固定30分钟,加AnnexinV 5μl,室温10min,用1×Binding Buffer洗一次,弃上清再加190μl 缓冲液、10μl PI避光15分钟

c) 加10μl PI,避光孵育15分钟; d) 加5μl AnnexinV液,室温避光孵育15min; e) 加10μl PI和5μl AnnexinV液,室温避光孵育5min;

3) 每管各加400μl 1×Binding Buffer。

4) 上机检测。

注意 a. 操作动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞;

b. 操作时注意避光;

c. 反应完毕后尽快检测,最好在一小时内检测。

3、用单克隆抗体APO2.7检测细胞凋亡

1) 放置0.5~1×106个细胞到试管中;

2) 室温离心200g,6min;

3) 弃上清,加入100μl冷的(4℃)在PBSF溶液中含100μg/ml的digitonnin,

轻轻地重悬细胞,在冰上孵育20min;

4) 加入2ml冷的(4℃)PBSF液,室温离心200g,6min;

5) 弃上清,加入20μl PE标记的Apo2.7 单克隆抗体和80μl PBSF液,用

vortex轻轻震荡,室温避光孵育15分钟;

6) 加入2ml PBSF液,室温离心200g,6min; 7) 弃上清,加入1ml PBSF液重悬细胞; 8) 避光保存,直到流式细胞仪检测。

PBSF:含2.5% FCS(v/v)和0.01%NaN3(w/v)的PBS。

三、用流式细胞术进行DNA周期分析 1、方法:同DNA含量检测

2、注意:

单细胞浓度应约106/ml,以免影响检测的CV值和检测结果;

制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量(如细胞是否聚集或过多碎片),以保证得

到足够的细胞含量;

醛类固定会影响PI与核酸的结合。

四、免疫荧光标记法 1、细胞膜上的免疫荧光检测法

间接标记法

1) 制备单细胞悬液;

2) 细胞计数,取出1×106个细胞于试管中; 3) 用台盼蓝染色计活细胞数,要求活细胞数 >90~95%;

4) 在试管中加入一抗,(剂量按照说明书的要求),孵育30~60分钟;

5) PBS洗涤1~2次,1500rpm,离心3分钟,弃上清;

6) 加入二抗,孵育20~30分钟;

7) PBS洗一次,1500rpm,离心3分钟,弃上清;

8) 加300μl PBS,上机检测(若不能及时上机检测,可加1ml 1%多聚甲醛

固定,可放置1周)。

直接标记法 ①~③同间接标记法

④在试管中加入荧光标记的抗体,混匀,孵育30分钟; ⑤用PBS洗2次,1500rpm,离心3分钟,弃上清;

⑥加300μl PBS(PH=7.4),上机检测。

2、细胞膜内的免疫荧光标记法

间接免疫荧光标记法

1) 取已制备好的单细胞悬液,用1~3%的多聚甲醛固定30分钟(也可4℃

保存过夜);

2) 用PBS洗两次,弃上清;

3) 细胞膜打孔,加入0.1%皂素 200μl,室温10分钟;

4) 用PBS洗涤两次;

5) 加入第一抗体,室温30~60分钟,或4℃过夜,同时须设阴性对照或同

型对照管;

6) 用PBS洗涤两次;

7) 加入二抗(荧光标记的抗体)室温20分钟,避光;

8) 用PBS洗涤1~2次,弃上清;