生物电子显微技术作业

课后作业A

1.上网搜索或查阅其他资料，列表简要说明你认为能用于生物形态、结构、功能观察研究的所有方法。以及这些方法的应用实例。 显微技术方法 解剖显微镜 复式显微镜 1、 偏光显微镜 应用实例 主要应用于在生物、医学领域广泛用于切片操作和显微外科手术 用于观察软木及其他植物组织 用于研究所谓透明与不透明各向异性材料的一种显微镜。凡具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然这些物质也可用染色法来进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。反射偏光显微镜是利用光的偏振特性对具有双折射性物质进行研究鉴定的必备仪器, 可用以做单偏光观察，正交偏光观察，锥光观察。 检术方式：1、正相镜检又称无畸变镜检，其特点是使用低倍物镜，不用伯特兰透镜（BertrandLens）,被研究对象可直接用偏振光研究。同时为使照明孔径变小，推开聚光镜的上透镜。正相镜检用于检查物体的双折射性。2、锥光镜检又称干涉镜检，研究在偏振光干涉时产生的干涉图样，这种方法用于观察物体的单轴或双轴性。在该方法中，用强会聚偏振光束照明。 使用特殊的暗视场聚光镜使照明光线偏移而不进入物镜，只有样品的散射光进入物镜。因而在暗背景上得到亮的像，与暗视场照明相反，照明的光线直接到达成像平面的，称明视场照明。 暗视场显微镜主要用于观察结构和折射率变化有关的物体，如硅藻、放射虫类、细菌等具有规律结构的单细胞生物以及细胞中的线状结构，如鞭毛、纤维等。用暗视场显微镜还可观察到物镜分辨极限以下的质点，但不适用于观察染色的标本。 相差显微镜有暗相差和明相差之分。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 倒置相差显微镜，是相差显微镜和倒置显微镜的结合，即既具有倒置显微镜的倒置观察方式，同时，成像原理则与相差显微镜成像原理相一致。可以很方便地对培养中的细胞进行观察。且相差系统的观察效果远好于一般光学观察系统。如果安装了显微操作系统，则可以利用机械臂对细胞甚至染色体进行精细地一、光学显微镜 2、暗视场显微镜 3、相差显微技术 正置相差显微镜 倒置相差显微镜 操作，如核移植、基因导入、染色体显微切割等。 能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。 使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。 荧光显微镜是以紫外线为光源， 用以照射被微分干涉差显微 4、荧光显微技术 荧光显微镜 检物体， 使之发出荧光， 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光。 全内角反射荧光显微镜，利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200 nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测标的，故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。 全内反射荧光显微镜 荧光显微CCD 是与荧光显微镜密切相关的数码摄像产品，一方面它可以将荧光显微镜拍摄的显微摄影产品通过usb接口传输到电脑中，便于图像的采集荧光显微CCD 研究，另一方面，通过荧光显微镜CCD我们可以拍摄到比单纯使用荧光显微镜更好的图片。荧光显微镜CCD可以连接荧光显微镜组成显微成像系统。 活体生物荧光成像技术是指在小的哺乳动物体内利用报告基因-荧光素酶基因表达所产生的荧光素酶蛋白与其小分子底物荧光素在氧、Mg2+离子存在的条件下消耗ATP发生氧化反应, 将部分化学能转变为可见光能释放。然后在体外利用敏感的CCD设备形成图像。荧光素酶基因可以被插入多种基因的启动子(promoter), 成为某种基因的报告基因, 通过监测报告基因从而实现对目标基因的监测。 活体体内荧光成像系统 5、聚焦显微镜 激光共聚焦扫描显微镜是用激光作扫描 光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的 激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点 即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。 由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦 激光扫描显微镜有较高的分辨率，大 约是普 通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描 限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可 以获得样品不同深度层次的图像，这 些图像信息都储 于计算机内，通过计算机分 析和模拟，就能显示细胞激光共焦扫描样品的立体结构。激 光共聚焦扫描显微镜既可以用于显微镜 观察细胞形 态，也可以用于细胞内生化成分的定量分（confocal 析。 它的主要特点是：①以激光作为光源。②采用 共laser 焦成像系统。③扫描、显示及记录系统。激 光具有发scanning 散角小、方向性好的优点，光束通过 聚焦后落在样品microscopy） （如细胞等）的不同深度；在 不同方向、不同深度的平面上进行聚焦扫描， 从而得到一系列不同层次的清晰图像。平面 间隔最小约600～800nm；利用微机图像合成 系统可重建细胞的三维图像，可以更精确地 检测、识别组织或细胞内的微细结构及其变 化 双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80 至 双光子共焦激100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光扫描显微镜 光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的， 双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。双光子荧光显微镜有很多优点：1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；4）使用双光子显微镜观察标本的时侯，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。