交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯

15、结合所学《微生物发酵工程》课程论述某个工业发酵产品的生产工艺流程（可画图说明），越详细越好。 答：①培养基制备 ②、无菌空气制备 ③、菌种与种子扩大培养 ④、发酵培养 ⑤、通过化学工程技术分离、提取、精制。

发酵工程

一、名词解释

1、分批发酵：在发酵中，营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放出，中间除了空气进入和尾气排出外，与外部没有物料交换。 2、 补料分批发酵：又称半连续发酵，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统不加一定物料的培养技术。 3、絮凝：在某些高分子絮凝剂的作用下，溶液中的较小胶粒聚合形成较大絮凝团的过程。

二、填空

1、 生物发酵工艺多种多样，但基本上包括菌种制备、种子培养、发酵和提取精制等下游处理几个过程。 2、 微生物的育种方法主要有三类：诱变法，细胞融合法，基因工程法。 3、 发酵培养基主要由碳源，氮源，无机盐，生长因子组成。

5、青霉素发酵生产中，发酵后的处理包括：过滤、提炼，脱色，结晶。

6、利用专门的灭菌设备进行连续灭菌称为连消，用高压蒸汽进行空罐灭菌称为空消。 7、可用于生产酶的微生物有细菌、真菌、酵母菌。 常用的发酵液的预处理方法有酸化、加热、加絮凝剂。

8、根据搅拌方式的不同，好氧发酵设备可分为机械搅拌式发酵罐和通风搅拌式发酵罐两种。 9、依据培养基在生产中的用途，可将其分成孢子培养基、种子培养基、发酵培养基三种。 10、现代发酵工程不仅包括菌体生产和代谢产物的发酵生产，还包括微生物机能的利用。

11、发酵工程的主要内容包括生产菌种的选育、发酵条件的优化与控制、反应器的设计及产物的分离、提取与精制。 12、发酵类型有微生物菌体的发酵、微生物酶的发酵、微生物代谢产物的发酵、微生物转化发酵、生物工程细胞的发酵。 13、发酵工业生产上常用的微生物主要有细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。

14、当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，从自然选育转向代谢调控育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。 15、根据操作方式的不同，液体深层发酵主要有分批发酵、连续发酵、补料分批发酵。

16、分批发酵全过程包括空罐灭菌、加入灭过菌的培养基、接种、发酵过程、放罐和洗罐，所需的时间总和为一个发酵周期。 17、分批发酵中微生物处于限制性的条件下生长，其生长周期分为延滞期、对数生长期、稳定期、衰亡期。 18、根据搅拌的方式不同，好氧发酵设备又可分为机械搅拌式发酵罐、通风搅拌式发酵罐。

19、下流加工过程由许多化工单元操作组成，通常可以分为发酵液预处理和固液分离、提取、精制及成品加工四个阶段。

20、当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向变异菌 ，从自然选育转向代谢调控育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。

21、微生物发酵产酶步骤为先选择合适的产酶菌株、后采用适当的培养基和培养方式进行发酵、微生物发酵产酶、酶的分离纯化、制成酶制剂。 四．简答

1、工业上常用的菌种保藏方法 ①斜面冰箱保藏法； ②沙土管保藏法； ③石蜡油封保藏法； ④真空干燥冷冻保藏法； ⑤液氮超低温保藏法 2、发酵培养基由哪些成份组成

（1）碳源 构成菌体和产物的碳架及能量来源

（2）氮源 构成微生物细胞物质或代谢产物中氮素来源的营养物质 （3）无机盐和微量元素 （4）生长因子

（5）水、产物形成的诱导物、前体和促进剂 3、根据操作方式的不同，发酵类型主要分成哪几种 （1）分批发酵 （2）连续发酵 （3）补料分批发酵 （4）固体发酵 4、简述发酵工程的类型

（1）微生物菌体发酵：以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵。

（2）微生物酶发酵：微生物具有种类多、产酶品种多、生产容易和成本低等特点。 （3）微生物代谢产物发酵：初级代谢产物、次级代谢产物。

（4）微生物的转化发酵微生物转化是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物。 （5）生物工程细胞的发酵：这是指利用生物工程技术所获得的细胞，如DNA重组的“工程菌”以及细胞融合所得的“杂交”细胞等进行培养的新型发酵，其产物多种多样。 5、简述发酵技术特点

①发酵过程以生命体的自动调节方式进行，数十个反应过程能够在发酵设备中一次完成； ②在常温常压下进行，条件温和，能耗少，设备较简单；

③原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，可以是农副产品、工业废水或可再生资源，微生物本身能有选择地摄取所需物质； ④容易生产复杂的高分子化合物，能高度选择地在复杂化合物的特定部位进行氧化、还原、官能团引入或去除等反应； ⑤发酵过程中需要防止杂菌污染，大多情况下设备需要进行严格的冲洗、灭菌，空气需要过滤等。

五、论述

1.论述液体深层发酵有哪些优点发酵方式分为几类 优点：

①是很多微生物的最适生长环境；

②菌体及营养物、产物易于扩散，使在均质或拟均质条件下进行，便于控制，易于扩大生产规模； ③液体输送方便，易于机械化操作；

④厂房面积小，生产效率高，易自动化控制，产品质量稳定； ⑤产品易于提取、精制等。 方式：

（1）分批发酵 ：营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放罐，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。

（2）连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。可以有效地延长分批培养中的对数期。

（3）补料分批发酵又称半连续发酵，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。 可以使培养液中的营养物浓度较长时间地保持在一定范围内，既保证微生物的生长需要，又不造成不利影响，从而达到提高产率的目的。 2、论述发酵下游加工过程 （1）预处理方法：

加热：适当加热之后，发酵液中的蛋白由于变性而凝聚，形成较大的颗粒，发酵液的粘度就会降低。此法仅适用于对非热敏感性产品发酵液的预处理。

调节PH值：适当的PH值可以提高产物的稳定性，减少其在随后的分离纯化过程中的损失。此外，发酵液PH值的改变会影响发酵液中某些成分的电离程度，从而降低发酵液的粘度。注意选择比较温和的酸和碱，以防止局部过酸或过碱。草酸较常用。

加入絮凝剂：通常情况下，细菌的表面都带有负电荷，可以在发酵液中加入带正电荷的絮凝剂，从而使菌体细胞与絮凝剂结合形成絮状沉淀，降低发酵液的上粘度，利于菌体的收获。

（2）固液分离方法：常用到过滤、离心等方法。如果欲提取的产物存在于细胞内，还需先对细胞进行破碎。沉淀提取法、色谱分离法、萃取法、膜分离技术

（3）精制：初步纯化中的某些操作，如沉淀、超滤等也可应用于精制。大分子(蛋白质)精制依赖于层析分离，小分子物质的精制则可利用

结晶操作

（4）成品加工：经提取和精制后，根据产品应用要求，有时还需要浓缩、无菌过滤和去热原、干燥、加稳定剂等加工步骤。

一、填空（20分，每空1分）

1.生长因子如氨基酸和核苷酸产生菌的分离用随机分离方法初筛，其 方法主要是通过观察分离菌能否促进 的生长，来检出生长因子产生菌。 2.紫外线的作用机制主要是形成 以改变DNA生物活性， 造成菌体变异甚至死亡。

3.目前常用的获得目的基因的方法有 、 和 。

4.末端产物（终产物）阻遏方式普遍存在于 、 生物合成途径中。 5.按照操纵子模型理论， 、 和 构成 操纵子。 6.在酵母Ⅱ发酵液中添加 ，发酵的终产物是 。 7.通过前体单体聚合的次级代谢物有 、 和 等抗生素。 8.抗生素生物合成中的所有甲基化作用均以 作为甲基供体。 方程的表达式为 ，它描述的是微生物生长和 之间的关系。 10.只含有单一液相，且粘度小的典型溶液属于 流体；含有 固相、气相和液相而且粘度较大的发酵醪属于 流体。 三、名词解释（共16分，每题4分）

1. 营养缺陷型 2. 酵母Ⅱ型发酵 3. 前体 4. 比生长速率（μ） 四、简答题（共24分，每题6分） 1. 分析工程菌质粒不稳定现象的原因 2. 有哪两种类型操纵子请说明其调节机制

3.易利用的基质如葡萄糖会产生代谢物阻遏，试阐明葡萄糖阻遏的作用机制 4. 种子培养基、发酵培养基、补料培养基的组成特点及其如何衔接 五、论述题（共20分）

1.有一培养基如下 : 甘露醇，MgSO4，K2HPO4，KH2PO4，CuSO4， NaCl，CaCO3，蒸馏水。试述该培养基的：A.碳素来源;B.氮素来源;C.矿质来源，该培养基可用于培养哪类微生物(8分)

2.为什么说在谷氨酸的合成中，糖的分解代谢途径与CO2固定的适当 比例是提高收率的关键（12分）

一、填空（20分，每空1分）

1.营养缺陷型 2.胸腺嘧啶二聚体 3.鸟枪法 cDNA法 人工合成 4.氨基酸 核苷酸 5.操纵基因 启动基因 结构基因 6.亚硫酸氢钠 甘油 7.四环类 大环内酯类 安莎霉素类 8.甲硫氨酸 9. 限制型基质 10.牛顿型 非牛顿型 三、 1. 营养缺陷型 是指丧失了合成某种营养物质的能力，在培养基中若不外加这种 营养成分就不能正常生长的变异菌株。营养缺陷型菌株不仅用于生 产，在分子育种工作中常用作选择性标记。

2. 酵母Ⅱ型发酵 是指酵母在有亚硫酸氢钠存在的情况下，亚硫酸氢钠和乙醛结合成复合物，致使乙醛不能作为受氢体，而迫使磷酸二羟丙酮代替乙醛作为受氢体，生成α-磷酸甘油。α-磷酸甘油在α-磷酸甘油磷酸酯酶的催化下水解，除去磷酸，生成甘油。

3. 前体 是指加入到发酵培养基中的某些化合物能被微生物直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化，且具有促进产物合成的作用。

4. 比生长速率 在微生物分批培养的对数生长阶段，菌体的生长不受限制，菌体浓度随培养时间呈指数增长，菌体浓度的变化率与菌体浓度成正比，即dX/dt=μX。μ称为比生长速率，反映的是单位体积的菌量（干重）在单位培养时间内所收获的菌量（干重）。 四、 1. 分析工程菌质粒不稳定产生的原因

答：工程菌质粒不稳定可分为分裂不稳定和结构不稳定两种情况。质粒分裂不稳定是指工程菌分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌。质粒结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失，引起工程菌性能的改变。 质粒不稳定常见的是分裂不稳定，主要与两个因素有关：一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率，主要发生在含低拷贝数的工程菌中；二是含质粒菌和不含质粒菌的比生长速率差异的大小。主要发生在含高拷贝数的工程菌中，因外源质粒大量的产生而造成这种差异，所以一旦产生不含质粒菌，则能较快地取代质粒菌成为优势菌。

2. 有哪两种类型操纵子请说明其调节机制

答：一类是诱导型操纵子，只有当存在诱导物（一种效应物）时，其转录频率才最高，并随之转译出大量诱导酶，出现诱导现象。 另一类是阻遏型操纵子，只有当缺乏辅阻遏物（一种效应物）时，其转录频率才最高。由阻遏型操纵子所编码的酶的合成，只有通过去辅阻遏物阻遏作用才能起动。

3. 易利用的基质如葡萄糖会产生分解代谢物阻遏，试阐明葡萄糖阻遏的作用机制

答：首先，葡萄糖的大量存在，降低了胞内 cAMP 浓度，其影响机制有以下两方面： 一方面，葡萄糖抑制腺苷酸环化酶活性，降低ATP生成 cAMP ，见下式： ATP → cAMP + Pii

另一方面，葡萄糖存在消耗胞内cAMP，引起ATP浓度上升，见下式： cAMP + H2O → ADP → ATP

其次，在操纵子的启动子上有两个结合位点，一个与cAMP－CAP（cAMP受体蛋白）复合物结合，另一个与RNA聚合酶结合；cAMP－CAP复合物能促进RNA聚合酶的结合和转录（活化），由于cAMP 浓度的降低，该复合物不能形成，使得RNA聚合酶也无法结合到启动子的位点上，结构基因不能转录和表达。

4. 种子培养基、发酵培养基、补料培养基的组成特点及其如何衔接