序列片断，搜索功能更加强大细致，改观了界面等等。使用Oligo自动搜索引物也未尝不可，尤其是6.22版本，引物搜索功能得到大幅提高，但在方便易用上稍不如Premier。

2. 使用（以Oligo 6.22为例）

Oligo 5.0的安装有个需要注意的地方，安装程序完毕后需要安装一种字体，不然碱基显示不清楚。在软件安装目录（默认为C:\\oligo）的\\system下，有一个字体文件，oli.fon。打开控制面板，选”字体”—“安装新字体”，找到该路径，安装即可。Oligo 6.22可免去此步骤。

起动Oligo 6.22并打开一个序列后，界面如下：

图中显示的三个指标为Tm，ΔG，Frq，其中Frq为6.22的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tili方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo 5.0，只是显示更清楚了。

经过Windows/Tili项后的显示如图：

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在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左下角的Upper按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。ΔG值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的ΔG值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（不要超过9如图：）

Tm值曲线以选取72度附近为佳，5’到3’的下降形状也

有利于引物引发聚合反应。Frq曲线为Oligo6新引进的一个指标，揭示了序列片断存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用Frq值相对较低的片断。

当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先需要检查的是引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。对于一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置，产物大小要求较低，应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。检测的第二项是发夹结构（hairpin）。与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好，一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然，在设计克隆PCR引物时，引物两端一般都添加酶切点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低，这种PCR需要灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。

检测的第三项为GC含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果不是在基因组中进行PCR，而是一个特定模板序列，那么最好还进行一下False priming site的检测。这项检测可以看出引物在非目的位点引

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发PCR反应的可能性。一般在错误位点的引发效率以不超过100为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130，并且不好找其他更合适的引物，那么这对引物也是可以接受的。如果引物在错误位点的引发效率比较高，PCR结果就可能出假阳性，这当然是我们不愿看到的。

当我们结束以上四项检测，按Alt+P键就出来PCR窗口，其中总结性地给出该引物的位置，产物大小，Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。

关于Oligo软件的引物自动搜索功能，因为与Primer Premier 5类似，并且似乎并不比它更好用，在此不再冗述。其实使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。

除了本地引物设计软件外，现在还有一些网上引物设计软件，如由Whitehead Institute 开发的Primer3，由European Molecular Biology Laboratory of Heidelberg开发的JaMBW（本网站http://210.72.11.60已引进并调试好这两种软件，欢迎使用）。该软件的独特之处在于，对全基因组PCR的引物设计，可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现并排除引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR的用户试用。

1od单位的干粉引物的质量相当于33ug.分子质量的计算公式为 MW(相对分子质量)=引物碱基个数x324.5 质量数=od值x33ug

引物微摩尔数=质量数/相对分子质量

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