虎纹蛙骨髓细胞染色体标本的制备及其染色体核型分析

赖标汶

（中山大学生命科学学院08级生态学 广州 510275）

摘要：采用虎纹蛙的骨髓细胞制作了虎纹蛙的染色体标本后，利用Photoshop和Excel等软件对其进行核型分析。核型分析时，通过计算染色体的相对长度、臂指数、着丝粒位置等三个重要参数，采用Levan 标准，对虎纹蛙的染色体进行类型分类。最后按染色体的大小和类型，配对排列后即得到虎纹蛙染色体的核型。结果表明，虎纹蛙的染色体组型为K（2n=26）=12m+14sm。

关键词：染色体标本；核型分析；虎纹蛙；Photoshop软件 引言

核型（karyotype）是指一个细胞内的整套染色体按照一定的顺序排列起来构成的图像。通常是将显微镜摄影得到的照片染色体照片剪贴而成，可以借助Photoshop软件进行分析。正常细胞的核型能代表个体的核型。核型的研究对人类医学遗传研究及临床应用，对探讨动植物起源、物种间亲缘关系，鉴定远缘杂种等方面都有重大意义。[1]

1 材料与方法 1.1材料

虎纹蛙 （中山大学细胞生物学实验室提供） 1.2试剂

Carnoy固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），0.1%秋水仙素溶液，0.65%生理盐水，1/15mol/L磷酸缓冲液（pH=7.4），Giemsa染液。 1.3方法

（1）实验前3~4h，按虎纹蛙每克体重2~4ug的剂量，腹腔注射秋水仙素。 （2）处死虎纹蛙后，立即取出股骨，用刀剔掉肌肉。

（3）用刀片切开股骨的两端，用盛有生理盐水的注射器插入股骨的上端，冲出骨髓细胞至离心管中，直至股骨变白位置。将收集的骨髓细胞平衡后放入离心机，以1000r/min离心10min。

（4）离心后，弃上清液，加入6ml蒸馏水，用吸管轻轻吹打成细胞悬浮液，低渗20min。 （5）加入5滴新配的固定液，立即打匀，并以1000r/min离心10min后，弃上清液。 （6）沿管壁慢慢加入6ml固定液，立即用吹管吹打成细胞悬浮液，室温下固定20min。1000r/min离心10min后弃上清液。 （7）重复步骤6的操作。

（8）沉淀物中加入0.3~0.5ml固定液，用吸管吹打成细胞悬液。

（9）用镊子取预先冰冻的干净载玻片，迅速滴上2~3滴细胞悬浮液，立即用嘴向同一方向吹气，使细胞分散均匀，然后置酒精灯上微微加热干燥。

（10）将晾干的玻片放在洁净的玻板上，用Giemsa染液染色30min，自来水冲洗，空气干燥。

（11）在显微镜下用低倍镜找到中期分裂相的细胞，转用高倍镜，选择染色体分散适度、长度适中的分裂相进行观察。并拍照。

（12）用Photoshop对照片中的染色体进行剪切、分离、配对。先目测配对。

（13）用Photoshop的测量工具，测量每条染色体短臂和长臂长度，计算出各条染色体的相对长度、着丝粒指数、臂指数，并记录原始数据。

（14）根据测量数据校正目测配对排列的结果，进行调整排列。

（15）把染色体按照一定顺序一对一地排列，按照从大到小，短臂向上，长臂向下，性染色体单独排列的规则排列，最后整成一张完整的染色体核型图。

2 实验结果

2.1虎纹蛙染色体数

选择合适的破裂细胞，在显微镜下观察计数知，染色体数目为2n=26的细胞占绝大多数，少数小于26的细胞是染色体在标本制备过程中缺失了。所以，虎纹蛙的染色体数目为2n=26。 图1是本实验的实验结果（由实验老师提供）。

图1 虎纹蛙骨髓细胞染色体（05级中医班同学制作的标本）

图2是本人实验的实际结果，由于染色体分离不开，且染色体歪曲变形，难以进行染色体核型分析，弃用。

图2 虎纹蛙骨髓细胞染色体（本人实验实际所得）

2.2染色体核型分析

2.2.1虎纹蛙染色体的核型图

根据图1，用Photoshop进行染色体的配对和一定顺序的排序，得到虎纹蛙的核型图(图3)。

图3 虎纹蛙染色体的数目和核型图（依据图1分析）

2.2.2虎纹蛙染色体的特征

依据染色体核型图和表1（附录在后）的数据。

（1） 有5对大型染色体（染色体相对长度>9）和8对小型染色体。按照Levan标准，依

据着丝粒指数和臂指数，对染色体进行分类，其中第1、5、6、8、12和13对共6对染色体为中部着丝粒染色体（m），而第2、3、4、7、9、10和11对共7对染色体为亚中部着丝粒染色体（sm）。没有亚端部着丝粒染色体（st），没有端部着丝粒染色体（t）。虎纹蛙染色体核型为K（2n=26）=12m+14sm。

（2） 第6对染色体的长臂有明显的次缢痕。这是虎纹蛙的一个染色体特征。但是没有发

现端粒、随体等。

（3） 没有发现明显的异型性染色体存在，染色体都可以配对。没有雌雄对照，难以判断

雌雄。而实际上，依据章菊明等人对虎纹蛙的研究，虎纹蛙没有异型性染色体存在。[2]