河南宏翔生物科技有限公司 河南省多功能生物蛋白工程技术研究中心
检测技术规范与标准方法 编号：HXSW/QC-001 修订：第 1 版 第2次修改 起草：杨晓君 日期：2013.10.27 批准：刘永垒 日期：2014年1月17日 还原糖和总糖的测定— 3,5-二硝基水杨酸比色法 1 目的
建立统一的发酵液中还原糖和总糖的定性检测方法，确保检验方法的一致性、科学性和准确性
2 范围
适用于微生物中心实验室实验、生产发酵液中还原糖和总糖的检验
3 责任者
发酵工艺实验员负责检验
4 正文
4.1 原理
还原糖是指含有自由醛基或酮基、具有还原性的糖类。黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比，在波长为540nm处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中还原糖的含量。
不具还原性的部分双糖或多糖经酸水解后可彻底分解为具有还原性的单糖。通过对样品中的总糖进行酸水解，测定水解后还原糖含量，可计算出样品的含量含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以系数0.9。
4.2 仪器和试剂
4.2.1 仪器
分光光度计、电热恒温水浴锅 、试管及试管架 、容量瓶 、移液器 、量筒。 4.2.2 试剂
4.2.2.1 1mg/ml葡萄糖标准液
准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，混匀，4℃冰箱中保存备用。 4.2.2.2 DNS 试剂（3,5-二硝基水杨酸）
将6.3g DNS和262ml 2mol/LNaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中，7-10天后使用。
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还原糖和总糖的测定—3,5-二硝基水杨酸比色法
4.3 操作步骤
4.3.1 葡萄糖标准曲线制作
取9支具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。
表1 葡萄糖标准曲线制作
试剂 葡萄糖标准溶液（mL） 蒸馏水（mL） DNS（mL） 葡萄糖含量（mg） OD540 0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6 1.2 0.8 1.5 1.2 7 1.4 0.6 1.5 1.4 8 1.6 0.4 1.5 1.6 将以上溶液，封口置沸水浴煮5min，冷浴冷却，定容至25mL，以0号管为对照，在540nm下测定吸光值，以葡萄糖质量为Y轴，吸光值为X轴，拟合曲线。
标准曲线为：
4.3.2 样品中还原糖和总糖的测定 4.3.2.1 样品中还原糖的提取
固体样品的制备：
准确称取1.00g样品，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后补足至50ml蒸馏水，搅匀，煮沸5min，使还原糖浸出。将浸出液(含沉淀)转移到50mL离心管中，于4000r/min离心5min，沉淀可用20mL蒸馏水洗一次，再离心，将两次离心的上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，即为稀释100倍的还原糖待测液（实际操作时可根据需要稀释至适当倍数：10、20、30、40、50、100、200等）。
生产发酵罐菌液检测样品的制备：
按照发酵罐取样的操作规程取样，并用洁净的三角瓶盛放。 取一定体积的发酵液在4000-12000rpm下离心去除去菌体。准确量取5ml发酵上清液（视含糖量高低而定，在发酵周期内不同时期取样数量应有所不同）于100ml容量瓶中，加入10ml 10%ZnSO4溶液，用碱液（NaOH 3mol/L）调节显碱性，以水稀释至刻度、摇匀；通过干燥滤纸过滤，即为稀释20倍的还原糖待测液。（实际操作时可根据需要稀释至适当倍数：10、20、30、40、50、100、200等）。
实验室三角瓶菌液检测样品的制备
无菌操作下取5mL菌液，在4000-12000rpm下离心去除去菌体。准确量取1ml发酵上清液，用水稀释至100mL，，即为稀释100倍的还原糖待测液（实际操作时可根据需要稀释至适当倍数：10、20、30、40、50、100、200等）。
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4.3.2.2 样品中总糖的水解和提取
准确称取1.00g(1mL)样品，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL6mol/L 的HCl，置沸水浴中加热水解30min(1滴酚酞试剂检测呈微红)。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6mol/L的NaOH中和至微红色(至中性)，用蒸馏水定容在100ml容量瓶中，混匀，即为稀释100倍总糖待测液（实验时可根据需要稀释至适当倍数10、20、30、40、50、100、200等）。
表2 样品还原糖测定
试剂 样品溶液(mL) 蒸馏水(mL DNS（mL） OD540 通过标准曲线计算得到的还原糖量（mg） 样品中还原糖或总糖质量分数（%） 4.3.2.3 还原糖和总糖的测定
取4支具塞试管，编号0、1、2、3。以制作标准曲线相同的方法，在1-3号试管分别加入1mL待测液和1mL蒸馏水，1.5mLDNS（保证与葡萄糖标准曲线制作相同的反应体系），而对照的0号管内做则加2mL的蒸馏水和1.5mLDNS。封口置沸水浴煮5min，冷浴冷却，定容至25mL。在540nm下测吸光值。
0 0 2.0 1.50 1 1.0 1.0 1.50 2 1.0 1.0 1.50 3 1.0 1.0 1.50 4.4 结果与计算
计算光密度的平均值，根据所得标准曲线即可得到的还原糖的质量C，按下式计算样品还原糖和总糖的含量。
ω1?C?V?100 mω2??1?0.9
计算公式由公式：还原糖（%）?查曲线所得葡萄糖毫克数?提取液总体积/测定时取用体积?100整理得到。
样品毫克数式中，ω1为还原糖（以葡萄糖计）的质量分数，%；
ω2为总糖的质量分数，%；
C为还原糖或总糖提取液浓度，mg/mL，本公式中C即为根据标准曲线计算得到的还原糖毫克数（测定
时取用体积为1mL）；
V为提取液的总体积，mL；（提取液的总体积即为稀释倍数） m为样品质量，mg。
4.5 实验注意事项
样品的稀释倍数要保证计算得到的葡萄糖浓度在标准曲线线性关系良好范围内。以往经验和文献报道表明，
OD540在0.1-0.4范围内数据较为真实。
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