内切1-4-葡聚糖酶论文：枯草杆菌Eng酶大肠杆菌周质高效表达的机制研究
【中文摘要】来源于枯草芽孢杆菌I15的内切1-4-葡聚糖酶,当在大肠杆菌中表达时,可高效分泌表达于大肠杆菌周质中,最适条件下表达量可达7.1g/L。于是利用信息学软件分析了Eng酶的信号肽,属于Ⅱ类SecB依赖型,因此,SecB分子伴侣蛋白应该和Eng酶的前体结合。随后,通过Pull-down实验,证明了SecB与Eng酶前体结合。同时,通过转化Ⅱ类TAT途径蛋白缺陷型突变体,发现外分泌量减少,因此判断Eng酶不仅利用SecB途径,还利用TAT途径。讲克隆得到的蛋白酶基因连接此信号肽,同样实现了高效周质表达。
【英文摘要】The beta-l-4-endouglucanase (Eng) of Bacillus subtilis strain 115 can high efficently express in the periplasma of Escherichia coli. The maximum amount of periplasmic expression is up to 7.1g/L. The signal peptide belongs to the TypeⅡ, and SecB dependance by the analyses of biological information. And then, I proved that the chaprone SecB could bind with the pre-mature Eng by pull-down assay. Furthermore, it was confirmed that the TAT path way also involed in the tranportion of Eng by the tranforming TAT mutational stain.
【关键词】内切1-4-葡聚糖酶 大肠杆菌周质 枯草芽孢杆菌I15 【英文关键词】beta-1-4-endouglucanase periplasma Bacillus subtilis strain 115
【目录】枯草杆菌Eng酶大肠杆菌周质高效表达的机制研究摘要4-58-139-1310-11
Abstract5
1 大肠杆菌分泌表达重组蛋白的研究进展
1.2 II型分泌系统
1.2.1.1 SecB依赖型
1.2.2 胞
1.1 I型分泌表达机制9
1.2.1 跨胞质膜的转运10-111.2.1.2 SRP途径11
1.2.1.3 TAT途径11
外分泌11-121.2.3 重组蛋白的转膜12-132枯草芽孢杆菌
115 Eng在大肠杆菌周质的高表达13-2213-1913
2.1.1 材料13-16
2.1 材料与方法
2.1.1.1 菌株、试剂及耗材2.1.1.3 引物13
2.1.1.4 溶液和配
2.1.1.2 培养基13
制13-1616-19
2.1.1.7 设备仪器162.1.2 方法与技术
2.1.2.2 大肠
2.1.2.4
2.1.2.1 Eng酶的扩增与载体构建16-18
杆菌BL21(DE3)表达18Eng酶活性检测18-19得目的片段19
2.1.2.3 Eng酶活性检测182.2 结果与分析19-21
2.2.1 PCR扩增获
2.2.4 蛋
2.2.2 pET 32b-Eng载体的构建19-20
2.2.6 酶活性分析20-21
白诱导表达分析2021-2223-26养基23
2.3 讨论
3 Eng酶分泌表达机制研究22-303.1.1 实验材料23-253.1.1.3 主要试剂23
3.1 材料与方法
3.1.1.2 培
3.1.1.1 菌株233.1.1.4 溶液配制
23-2425-26
3.1.1.5 仪器设备24-253.1.2.1 胞浆Pull-down25
3.1.2 实验方法3.1.2.2 转化突变体
3.2 结3.2.2
E.coli MC4100(DE3)和其缺陷B1LKO(DE3)(△tatC)25-26果与分析26-28
3.2.1 Eng信号肽信息学分析26-27
SecB蛋白与前体Eng的结合27表达变化差异分析27-28
3.2.3 TAT野生型与突变体(TatC)
4 Eng酶信号肽引导
4.1.1 材
3.3 讨论28-30
碱性蛋白酶基因的表达30-40料31-3431
4.1 材料与方法31-37
4.1.1.1 菌株、试剂及耗材314.1.1.2 培养基
4.1.1.7
4.1.1.3 引物314.1.1.4 溶液和配制31-33
设备仪器33-344.1.2 方法与技术34-374.1.2.1 Eng酶信号
肽和Sap的扩增与载体构建34-35中表达35
4.1.2.2 大肠杆菌BL21(DE3)
4.1.2.4
4.1.2.3 周质与胞内重组蛋白提取35-36
Western-blot检测蛋白酶的表达3636-37
4.2. 结果与分析37-38
4.1.2.5 蛋白酶活性检测4.2.1 带有Eng信号肽的蛋白
酶(Sap)的诱导表达3737-38
4.2.2 重组碱性蛋白酶(Sap)的活性检测参考文献40-46
个人简介46-47
4.3 讨论38-40
致谢47