20~30bp的核苷酸序列，供设计一对引物之用。PCR的模板是一条单链DNA片段，其3’端具有与引物杂交的序列。 ⑤ 耐高温DNA聚合酶

31、耐高温DNA聚合酶的种类、各自的特点 ①Taq DNA聚合酶，来自嗜热古细菌Thermus aquaticus。该菌1967年从温泉中分离，最适生长温度70℃。现市场上销售的是该基因在E.coli细胞中的表达产物。

特征：相对分子质量为94×103，为单分子酶，具较强的5’→3’DNA聚合酶活性和较弱的5’→3’外切酶活性，缺乏3’ → 5’外切酶活性。最适pH9.0，最适反应温度75℃。合成出错几率8.9×10-5～1.1×10-4。 ②Pwo DNA聚合酶

来自喜温性古细菌Pyrococcus woesei。现市场上销售的是该基因在E.coli细胞中的表达产物。

特征：相对分子质量为90×103，具较强的5’→3’DNA聚合酶活性，兼3’→5’外切酶活性。耐热性更高，保真度比TaqDNA聚合酶高10倍。 ③Tth DNA聚合酶

来自喜温性真细菌Thermus thermophilus HB8。具较强的5’→3’DNA聚合酶活性，缺乏3’ → 5’ 外切酶活性。最适pH9.0，最适反应温度75℃。Mg2+存在时，以DNA为模板合成DNA，Mn2+存在时，可以RNA为模板合成cDNA，用于RT-PCR系统。 ④ Vent DNA 聚合酶

来自嗜热高温球菌Thermococcus litoralis 。相对分子质量85×103。100℃时该酶半衰期为1.8hr，具有3’ → 5’ 外切酶校对活性。合成的准确度比用Taq DNA 聚合酶高5 ～ 15倍。

⑤Pfu DNA 聚合酶

来自激烈热球菌Pyrococcus fariosus。保真度较高。（3’→5’外切酶活性）目前错配率最低。

⑥KOD DNA 聚合酶

特征：①具有强力的3’→5’核酸外切酶活性，与Taq DNA聚合酶相比，保真度比后者高50倍左右。②合成速度比Taq DNA聚合酶快2倍，比Pfu DNA聚合酶快6倍。③耐热性比Taq DNA聚合酶好，在100℃、1小时的热处理后仍可保持约70％的活性，故根据需要可以将热变性步骤的温度设定值提得更高，这对处理GC含量高的模板等具有特异性高级结构的样品非常有利。

⑦高保真 DNA 聚合酶

Phusion 高保真DNA聚合酶 (Finnzymes )，Phusion采用一种新的蛋白融合技术，与一种独特的双链DNA结合蛋白融合后，可以和模板更加紧密的结合，触发更为强劲和快速的扩增，它甚至可以用于结合那些最难被结合的模板, 持续扩增能力（processivity，决定最大扩增长度）是Pfu酶的10倍，Taq酶的2倍。 ⑧ 商用混合 DNA 聚合酶 Ex Taq DNA聚合酶

Ex Taq Hot start DNA聚合酶 LA Taq DNA聚合酶

LA Taq Hot start DNA聚合酶

为了提高扩增的保真度或扩增较长DNA片段，将Taq DNA聚合酶的强启动能力和具有3’→5’外切酶活性高温DNA聚合酶的高持续活性和校正功能结合起来，可以达到很好的效果。 32、PCR平台期的概念、出现平台期的原因

平台期：

出现平台期的原因可能有：

①后期循环酶浓度或聚合时间不足； ②引物耗尽； ③dNTP耗尽；

④产物浓度过高，以致dsDNA解链后又迅速退火，不能与引物结合。 33、PCR产物克隆的几种方式

①在PCR产物两端添加限制性酶切位点；②A/T克隆法；③平末端DNA片段的克隆；④长片段DNA的PCR扩增

34、PCR扩增未知片段的几种方式

①反向PCR；②利用接头的PCR；③热不对称交错PCR

35、RACE、DD-PCR、RAPD、AFLP的概念、原理（参见PPT）

第九章 DNA序列分析

36、两种不同的测序方法的基本原理 ⅠMaxam-Gilbert 化学降解法

将待测DNA片段的5’端磷酸基团作放射性标记，再分别采用不同的化学方法对特定碱基进行化学修饰并在该位置打断核酸链，从而产生一系列5’端被标记的长度不一且分别以不同碱基结尾的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过并列点样的方式用凝胶电泳进行分离，再经放射自显影，即可读出目的DNA的碱基序列。 ⅡSanger双脱氧链终止法

双脱氧核苷酸（ddNTP）分子的脱氧核糖的3’位置的羟基缺失，当它与正常核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在DNA聚合酶的作用下，虽然它也能参与DNA合成，但由于其3’位置的羟基缺失，使其下面的核苷酸的5’磷酸基无法与之结合。也就是说，一旦双脱氧核苷酸整和到正在合成的DNA链中，该股DNA的合成就到此终止。 37、序列分析的基本步骤 1、模板制备和引物设计

模板：单链或双链DNA，必须保证足够的浓度

引物：18-22nt，55-60℃，尽量避免3个以上碱基重复， 尽量减少发夹结构形成的可能性。 2、经典测序方法的反应步骤

? 模板变性 ? 退火 ? 标记

掺入标记：[α-32P]dATP、 [α-33P]dATP、 [α-35P]dATP 末端标记： [γ-32P]rATP

? 延伸

? 电泳分析和数据读取 38、大片段DNA序列测定的方法

①通用引物指导未知序列的测定；②引物步移；③随机克隆测序；④缺失克隆测序

第十章 DNA诱变

39、定向进化的概念

对于某些实验目的，一次突变很难获得满意的结果，通常采用反复多次诱变和循环，其目的是获得满足人们需要的性能改良的蛋白质，又称为试管进化。 40、随机诱变的方法、原理

1）错误掺入突变，在体外DNA扩增中，使用具有错配倾向的DNA聚合酶以及反应条件，使碱基错误掺入到新合成的基因中，又称易错PCR（error-prone PCR）。热稳定TaqDNA聚合酶和突变DNA聚合酶

error-prone PCR的实质：通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中突变的频率，降低聚合酶固有的突变序列倾向性，提高突变谱的多样性，使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中，从而得到随机突变的DNA群体，最后用合适的载体克隆突变基因。 2）盒式诱变 ①盒式取代诱变；简单的盒式取代诱变是通过限制性酶切除去特定的双链DNA片段，再与含有突变的单一序列双链寡核苷酸连接,得到取代突变，是一种定点诱变。 ②混合寡核苷酸诱变；若用于取代的是含有随机突变的混合双链寡核苷酸，则可在限定区域内引入大量的随机突变。 3）增变菌株的诱变作用

概念：与DNA错配校正功能和DNA损伤修复有关的基因突变后，细胞内基因的突变频率大大增加，这样的菌株叫增变菌株（mutator strain）。 常用增变菌株：E.coli XL1 - Red (mutD mutS mutT)

mutD突变造成DNA聚合酶Ⅲ的3’→5’外切核酸酶活性缺陷，失去错配碱基的校正功能； mutS突变使DNA错配修复系统失去功能；

mutT突变不能水解dGTP的氧化产物8-oxodGTP， 8-羟基鸟嘌呤在复制时掺入DNA中，造成突变。

4）化学诱变

用化学诱变剂处理双链DNA片段，将发生随机突变的片段群体克隆到合适的宿主中，构建成一个重组突变体库。用适当的功能分析可鉴别携带突变的重组子。 41、体外重组的种类、概念、特点 ①DNA洗牌法（DNA shuffling），是通过对一组序列相关DNA序列，经过超声波处理或在DNaseI的作用下随机切成小片段，然后在没有引物的情况下，采用有性PCR方法进行合成；随着循环数的增加，PCR产物将越来越接近切割前的目的基因的长度；最后用基因两侧的引物合成全长的基因。（筛选瓶颈）有性PCR DNA shuffling技术的优点：①可在短时间内通过重组有效的突变体发掘所有可能的重组体与突变序列，从而大大加快进化速度；而且对可操作的靶序列没有任何要求，长度可达几十kb;②通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高；③从表型上早期进行选择，而不必了解DNA片段上序列的信息，简化了操作程序；④比随机突变显著提高了良性突变的概率。 ②交错延伸重组

交错延伸重组是一种简化的DNA shuffling技术。它不是由短片段组装全长基因，而是在PCR样反应中将含不同点突变的模板混合，随之进行多轮变性、短暂（5sec）复性/延伸反应，在每一轮PCR循环中，那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复直到获得全长基因片段，重组的程度可通过调整反应时间和温度来控制。（控制温度，退火，延伸时间） ③随机引发重组

RPR以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。

该法可以用一条DNA单链为模板，因此可以直接以cDNA为模板进行随机引发重组。

42、传统的定点诱变的方法、原理 ①Kunkel定点诱变法（又称“U”法）（参见PPT）

原理：dut-：dUTP酶（dUTPase）缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP，因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由T占据的位置。 ung-：UDG酶缺陷，UDG酶[尿嘧啶-N-糖基化酶]可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基

在体外用诱变引物合成的杂合双链DNA在导入正常ung+ dut+菌株后，只有带有突变位点的新合成链和作模板进一步复制，而野生型不能复制。这样能够生长的细胞就带有突变位点。（插入M13的DNA可以分别回收到两种形式：dsDNA和ssDNA） ②位点选择诱变（参见课本P179）

位点选择诱变法使用了2个寡核苷酸引物，一个是用来引入突变的引物，另一个是用来选择用的。选择性引物可用来恢复有缺陷的抗生素抗性基因，同时可用来选择引入突变的DNA链。 特点：可正向选择突变链，使用高保真的T4DNA聚合酶合成DNA，可以使用双良DNA作模板，可进行多轮筛选。但需特定载体，即含有一个有缺陷的抗生素抗性基因。 ③转化子诱变（参见课本180）

转化子诱变也使用了2个寡核苷酸引物，除了突变引物外，还使用了1个用来剔除单一酶切位点的引物。因此该方法也称酶切位点剔除法。将待突变的DNA片段装载到克隆载体上，该载体上必须存在1个单一酶切位点。当这两个引物同时指导DNA合成时，突变的DNA链将不再含有该单一酶切位点，而模板DNA在该位置能被切割。通过转化大肠杆菌，线性化的模板DNA不能复制，只有突变保持环状，可以获得转化子。 43、PCR介导的定点诱变的方法、原理

大引物PCR诱变；重叠延伸PCR诱变；重叠延伸剪接技术；同源重组法；双向PCR快速定点诱变

44、PCR介导的定点诱变方法中，模板DNA的排除方法

限制性内切酶 DpnI 可特异性切割dsDNA中的Gm6ATC位点，对半甲基化的DNA效率较低，完全不能切割非甲基化DNA。大肠杆菌体内DNA在Dam甲基化酶催化下完全甲基化，对DpnI 敏感。用4种通用dNTP在体外合成的DNA没有甲基化，可以抵抗DpnI的切割。

第十章 DNA文库的构建和目的基因的筛选

45、基因组DNA文库、cDNA文库的概念 基因组DNA文库：将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。 cDNA文库（针对真核生物）：若这些阳性菌落中所含的外源DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA，则称之为cDNA文库。cDNA不含内含子。

46、构建基因文库的基本程序

提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA；

DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA； 重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌； 阳性重组菌落或噬菌斑的选择。 47、鸟枪法的概念（质粒文库） 鸟枪法（霰弹法）：利用机械剪切力和超声波等物理方法或限制性核酸内切酶酶切等生化方法将生物chr.打断，随后通过T4 DNA连接酶把这些片段与适当的质粒载体进行重组，转化受体菌后进行无性繁殖，获得一大群含不同外源DNA片段的克隆，再用简便的筛选方法从众

多的转化菌株中筛选出含有某一目的基因的菌株，从中获得所要的基因。 48、文库的代表性和随机性的意义

代表性：指文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段 DNA 。代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标。 完整的基因文库所需克隆的计算公式：PPT 49、基因组DNA文库的构建流程及注意事项 1）．基因组 DNA 文库的载体制备

载体的制备要求：①纯度高；②去磷酸化好。 2）．高质量大分子量基因组 DNA 的提取和部分酶切 提取的基因组 DNA 要求保存完整。

分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。 3）．文库的连接转化或包装侵染

在电转化和包装侵染过程中，首先选择转化效率高的感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白；同时，研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率。另外，对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入片段的 DNA 的转化效率也有所不同。 4）．文库的质量检测

文库的平均插入片段长度是通过 PFGE 电泳检测一定数目的重组子的插入片段大小所得平均值。美国的研究机构对 BAC 文库，一般要求植物的在 130kb 左右，而动物的在 150kb 左右。

插入效率：有插入片段的克隆在所有检测的克隆中所占的比例。

基因组覆盖倍数＝平均插入片段长度×克隆数/基因组 DNA 的长度（一般是约数 ）；

基因组覆盖度是指文库中的克隆覆盖基因组的范围，检测时是通过选择一定数目的已知的单拷贝的基因作探针来筛选文库。由于所使用的每个探针筛选的克隆数目即表明文库中对该基因位点的覆盖倍数，因此，基因组覆盖倍数又等于所有探针筛到的阳性克隆的总个数/使用的总探针数的比值 50、cDNA文库的构建步骤

细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；第一链 cDNA 合成；第二链 cDNA 合成；双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。双链cDNA文库非自然存在，病毒中逆转录成单链DNA。

51、cDNA第一、第二链的合成方法

第二条链：自身引导法；置换合成法；引导合成法；引物－衔接头合成法 52、文库中目的基因的筛选方法

表型筛选法；杂交筛选（差别杂交 、mRNA 减法杂交、抑制性差减杂交）；免疫筛选；高表达基因 ；mRNA差别显示；酵母双杂交系统 53、酵母双杂交的作用原理（参见PPT）

酵母双杂交原理：利用融合蛋白的策略，将蛋白X与BD融合，蛋白Y与AD融合，将它们导入酵母细胞中共表达，如果X和Y相互作用，则会导致BD与AD在空间上接近，形成一个有功能的转录激活因子激活下游报告基因的表达。