PDA培养基的配制方法

一、目的要求

1．学习并掌握配制培养基的一般方法和步骤。 2．学习并掌握棉塞的制作方法。 二、培养基的配制原理

培养基是人工配制的各种营养物质供微生物生长繁殖的基质，用以培养、分离、鉴定、 保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加上实训 和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，但不论是何种培养基，均应含有水分、碳源、 氮源、能源、无机盐等。不同微生物对pH值要求不一样，所以配制培养基时，还应根据不 同微生物对pH值的要求，将培养基调到合适的pH值范围。

三、实训材料和用具

琼脂，可溶性淀粉，葡萄糖， 10﹪NaOH，10﹪HCl，1mol／L NaOH，lmol／L HCl，KNO3，NaCl，K2HPO4·3H20，MgSO4·7H20，FeSO4·7H2O；试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，天平，牛角匙，PH试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，纱布， 四、操作方法与步骤 (一) 培养基的配制

PDA培养基的配制 其配方如下：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL，pH值自然。

(1)称量和熬煮 药品实际用量计算后，按培养基配方逐一称取去皮土豆。土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20－30min，用可用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。滤液补充水分到1000ml。

(2)加热溶解 把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g（提前搞碎），然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所需量。

(3)分装 按实训要求，将配制的培养基分装入试管或500ml三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染。

分装量：固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面，分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜；半固体培养基以试管高度的1／3为宜，灭菌后垂直待凝。

(4) 加棉塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞(或泡沫塑料塞或试管帽等)，以阻止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能。

(5)包扎 加塞后，将全部试管用麻绳或橡皮筋捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳或橡皮筋扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。

(二) 棉塞的制作

棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染；二是可过滤空气，保证通气良好，并可减缓培养基

水分的蒸发，所以正确地制备棉塞是培养基制备中重要的一环。正确的棉塞是形状、大小，松紧应与试管口(或三角烧瓶)完全适合。过紧则妨碍空气流通，操作不便；过松时，空气会毫无障碍地进入试管(或三角烧瓶)中，达不到灭菌的目的。棉塞过小往往易掉进试管内，因此棉塞质量的优劣对实训的结果有很大的影响。正确的棉塞头较大，加塞时，应使棉塞长度的1／3留在试管口外，2／3在试管口内（见实训图6-4）。目前，有条件的实训室已使用坚固的塑料试管帽、金属试管帽、硅胶泡沫塞替代棉塞，制作棉塞要选纤维较长的棉花，一般不选用脱脂棉。因为它容易吸水变湿，造成污染，而且价格也贵。棉塞制作方法见图6-5

实图6-4棉塞 实图6-5 棉塞的制作方法 （三）斜面与平板培养基的制作

斜面与平面培养基是常用的琼脂固体培养基。将熬制好的琼脂培养基趁热装入试管灭菌后摆鞋面，凝固后即成斜面培养基。斜面培养基常用于菌种培养、菌种保藏等工作。将灭菌后的琼脂培养基倾注于无菌培养皿中，凝固后即成平板培养基。平板培养基常用于分离菌种、菌落计数、菌落形态观察及菌种鉴定等。斜面与平板培养基的制作过程大致为：溶解原料、融化琼脂、调PH、分装、灭菌和制斜面或平板。

1、溶解原料

为加速原料的溶解，最好用热水。先将原料依次加入到占配制量一半的水中，待全部溶解后在加足水量。如配方中有马铃薯、麸皮、胡罗卜、豆芽等天然原料，需将其熬制约30min，取出定量滤液，在将所需的其他原料加入滤液中。 2、融化琼脂

琼脂的用量可灵活掌握。用作保藏菌种的培养基，琼脂用量可提高至2.5%，以增加持水性。冬季的气温低，琼脂用量可适当减少。琼脂用前可剪成小段，以利于融化。待溶液煮沸是再加入，不断搅拌至完全无琼脂块状物时再停止加热。 3、调整PH

用洁净干燥的玻璃棒沾一点培养基滴在试纸上，立即与比色板比较。一般用10%NaOH或HCl调节。 4、分装

将培养基趁热倒入垫有纱布的漏斗中，使培养基直接滤至试管或三角瓶中，试管装量一般

为管高的1/4左右，三角瓶的装量约为其容量的一半。勿使培养基玷污容器口部。口部塞有棉塞，试管每7或9 支扎一捆，棉塞外面包牛皮纸，以防在灭菌过程中被水汽打湿。

5、灭菌

分装后的培养基应随即灭菌。除特殊情况外，一般培养基均用高压蒸汽灭菌，在104kPa压力下，灭菌20-30min 。

6、制作斜面或平板

将灭菌后的试管趁热斜置于棍条上，倾斜度以试管中的培养基约占试管长度的1/2为宜，凝固后即成斜面培养基。待灭菌后三角瓶内的培养基冷却至45~50时，以无菌操作法向无菌培养皿中倒入培养基，装置以刚覆盖整个培养皿底部为宜（约15ml）,凝固后即成平板培养基。

五、高压蒸汽灭菌法

该法使用高压灭菌锅，在121℃，O．105MPa压力下灭菌15～30min。微生物实训所需的一切器皿、器具、培养基(不耐高温者除外)、无菌水、工作服等物品都可用此法灭菌。

高压蒸汽灭菌锅是能耐一定压力的密闭金属锅，有立式或卧式(实图8-1、2 )两种。 灭菌锅上附有压力表、排气阀、安全阀、加水口、排水口等。卧式灭菌锅还附有温度计。有的还有蒸汽人口。灭菌锅的加热源有电、煤气和蒸汽三种。

高压蒸汽灭菌的操作过程

(1) 加水 将灭菌锅内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，以水面与三角架相平为宜。立式锅是直接加水至锅内底部隔板以下1／3处。有加水口者由加水口加入至止水线处。

(2) 装料 将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。放置装有培养基的容器时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以防冷凝水沾湿棉塞。

(3) 加盖 摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，打开排气阀。

(4) 排气 用电炉或煤气加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出。一般认为，当排气流很强并有嘘声时，表明锅内空气已排净(沸后约5min)。

(5) 升压 当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。