第八章 微生物的生长繁殖及其控制

重点与难点剖析

一、微生物生长繁殖的概念

微生物的生长是指细胞物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。当细胞个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加即繁殖。在高等生物里这两个过程可以明显分开，但对低等特别是单细胞的微生物，由于细胞小，这两个过程紧密联系、很难划分，因此，微生物的生长繁殖，一般指群体生长，这一点与研究动物、植物有所不同。 1、 细菌一般没有有性繁殖，多采用二分裂方式。

2、 真菌除了进行无性繁殖，产生大量孢子如分生孢子、节孢子、厚垣孢子、孢囊孢子等外，还能进行

有性繁殖，产生有性孢子如卵孢子、接合孢子、孢囊孢子等。 二、微生物生长的测定

微生物生长：单位时间里微生物数量或生物量（Biomass）的变化

个体计数

微生物生长的测定： 群体重量测定

群体生理指标测定

（一）以数量变化对微生物生长情况进行测定

通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长或样品中所含微生物个体的数量（细菌、孢子、酵母菌）。

1、培养平板计数法

样品充分混匀后，取一定量的稀释液涂布或倾注在平板上，进行培养，统计平板上长出的菌落数。注意： 1） 同一稀释度三个以上重复,取平均值；

2） 每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；

一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数。 2、膜过滤培养法

当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。 3、The most probable number method（液体稀释法） 1）未知样品进行十倍稀释；

2）取三个连续的稀释度平行接种多支试管并培养； 3）长菌的为阳性，未长菌的为阴性； 4）查表推算出样品中的微生物数目； 4、显微镜直接计数法

采用细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数，计算一定容积里样品中微生物的总数量。

缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；

（二）以生物量为指标测定微生物的生长 1、比浊法

在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(optical density, 即O.D.)表示菌量。多应用于单细胞微生物的培养。 2、重量法

以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量。或通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；

该方法适合于测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法。 3、 生理指标法

1

微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。

样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。 三、生长曲线(Growth Curve)：

细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。一条典型的生长曲线可以分为：迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期四个生长时期。 1、 延缓期（Lag Phase）:

将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零，该时期又称延迟期、适应期。 迟缓期出现的原因：

微生物接种到一个新环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时。 在生产实践中缩短迟缓期的常用手段

(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短； (2)利用对数生长期的细胞作为种子；

(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大； (4)适当扩大接种量

2、指数生长期(exponential phase)：

以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加，细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。

对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。

几个重要的生长参数：

代时(Generation time)通常以G表示，是指在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时，在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间（Doubling time）。

n

Nt= N0 X 2

繁殖一代所需的时间：

t1 – t0 0.639

G = —————— = ————— n μ

μ：比生长速率：单位时间内生长的速度。 纳米细菌（nanobacteria），三天才分裂一次；

3、稳定生长期(Stationary phase)：又称恒定期或最高生长期：

由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数)。此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。稳定生长期是细胞重要的分化调节阶段。

1） 开始储存糖原等内含物；

2） 形成芽孢或建立自然感受态（芽孢杆菌）；

3） 发酵过程积累代谢产物的重要阶段；某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期 4、衰亡期（Death phase）

营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。 衰亡期特点：

1） 细菌代谢活性降低；

2

2） 细菌衰老并出现自溶；

3） 产生或释放出一些产物；如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。

4） 菌体细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊；有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴

性反应 5、二次生长：

不同的微生物或同一种微生物对不同物质的利用能力是不同。有的物质可直接被利用(例如葡萄糖或NH4+等)；有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力（例如乳糖或NO3-等）。前者通常称为速效碳源（或氮源），后者称为迟效碳源（或氮源）。当培养基中同时含有这两类碳源（或氮源）时，微生物在生长过程中会形成二次生长现象。 四、同步培养(Synchronous culture)

使群体中的细胞处于一致，生长发育均处于同一阶段，即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。

获得同步培养细胞的方法：

离心方法

机械方法 过滤分离法

硝酸纤维素滤膜法

温度

环境条件控制技术 培养基成份控制

其他（如光照和黑暗交替培养）

同步培养常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。 五、连续培养 (Continous culture )

在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。

培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。

恒浊连续培养：不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定。 连续培养

恒化连续培养：保持恒定的流速

六、环境对微生物生长的影响

影响微生物生长的外界因素很多，除营养条件外，还有许多物理条件。其中最主要的有温度、pH和氧气。 1、 营养物质

2、水活性 微生物在生长过程中对培养基的aw有一定要求。

细菌 0.91；酵母菌 0.88；霉菌 0.80；嗜盐细菌 0.76；嗜盐真菌 0.65；嗜高渗酵母 0.60

3、温度

最低生长温度（一般为-5~-10℃，极端为-30℃） 嗜冷菌（≤20℃） 生长温度的三基点 最适生长温度 中温菌（20~45℃）

嗜热菌（≥45℃）

最高生长温度（一般为80~95℃，极端为105~300℃） 4、氧气

专性好氧菌：在正常情况下（0.2巴）进行好氧呼吸和产能 好氧菌 兼性厌氧菌：以呼吸为主，兼营发酵产能 以呼吸为主，兼营厌氧呼吸产能 微生物与氧 微好氧菌：只能在0.01~0.03巴的大气压下生活。

3