各生理指标的测定方法

一、脯氨酸含量的测定

1. 茚三酮法 1.1原理

在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加10-100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。

用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。

1.2步骤 试剂：（1）25%茚三酮：茚三酮------------0.625g 冰乙酸------------15ml 6mol/L磷酸--------10ml 70°C水浴助溶；

（2）6mol/L磷酸：85%磷酸稀释至原体积的2.3倍； （3）3%磺基水杨酸：磺基水杨酸------3g 加蒸馏水至------100ml 实验步骤： （1）称取0.1g样品放入研钵，加5ml 3%磺基水杨酸研磨成匀浆，100°C沸水浴15min；

（2）冰上冷却，4000rpm离心10min；

（3）提取液2ml+冰醋酸2ml+25%茚三酮2ml混合均匀，100°C沸水浴30min，冰上

冷却；

（4）加4ml甲苯混合均匀，震荡30s，静置30min； （5）以甲苯为空白对照，再520nm下测定吸光值。 1.3 计算方法

脯氨酸含量（μg/gFW）＝ X * 提取液总量（ml）/

样品鲜重（g）*测定时提取液用量（ml）*10^6

公式中：X-----从标准曲线中查得的脯氨酸含量（μg） 提取液总量---------------------------5ml 测定时提取液用量---------------------2ml 问题及质疑：

1.酸性体系下，脯氨酸与茚三酮加热反应后的最终产物为红色，再实验过程中，仅有少数时候能发现红色产物。原因有待确定。

2.经查看文献资料，反应步骤已经是优化的，没有问题。甲苯萃取脯氨酸与茚三酮的反应产物，消除了多余未反应的茚三酮，磺基水杨酸，提取液中其他杂质（如色素）以及PH变化

的干扰。

3.根据茚三酮与脯氨酸的缩合反应分析：

（1）反应体系的PH控制很重要，保持酸性环境，否则，反应产物的最大吸光值并不在520nm。 （2）极限干旱材料或者重脱水材料的脯氨酸含量大，材料干重比新鲜材料多数倍，加相同量的茚三酮，反应程度应该有所不同。而脯氨酸含量少的样本，容易受到各种因素的干扰。

二、

1. 原理

植物在逆境下遭受伤害（或衰老）与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关，膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛（MDA）是膜脂过氧化最重要的产物之一，因此可通过测定MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。

丙二醛在 高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（TBA）反应产生 红棕色的产物3,5,5′-三甲基恶唑2,4-二酮（三甲川），该物质在 532 nm处有一吸收高峰，并且在 660nm处有较小光吸收。由于醛、可溶性糖对此反应有干扰，在 450 nm处有一吸收峰，用双组分分光光度法加以排除。

2. 步骤 试剂：（1）10%三氯乙酸（TCA）：TCA--------------25g 加ddH2O至---------250ml （2）0.6%硫代巴比妥（TBA）：TBA------------0.6g 加5%TCA至---------100ml

实验步骤：

（1）称取材料0.1g，加10% TCA 2ml研磨至匀浆，再加8ml进一步研磨； （2）4000rpm离心10min，取上清至新管；

（3）2ml提取液+2ml 0.6% TBA，混合均匀，2ml ddH2O+2ml 0.6% TBA为空白对

照；

（4）混合沸水浴15min，冰上冷却；

丙二醛含量的测定

（5）4000rpm离心10min；

（6）取上清再532nm，600nm，450nm波长下的光密度值。 3. 计算方法

式中，Vt：提取液总体积（mL）----------------10ml； Vs：测定用提取液体积（ml）-------------2ml； FW：样品鲜重（g）---------------------0.1g。 注意事项：

1．可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收（最大吸收在450 nm），当植物处于极度干旱时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。

2．低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+（最终浓度为0.5 nmol · L-1）

3．如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。

三、过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法

【原理】

过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。

2e－

R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH)

－

2e－

R(Fe+3OH)2+H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2

－ 据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2

5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4

即可求出消耗的H2O2的量。 【仪器和用具】

研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；容量瓶25ml×1。 【试剂】

10% H2SO4；0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8；

0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定；

0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；

0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4 ·2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。 【方法】

1.酶液提取 取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

2.取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。

3.用0.1mol/L KMnＯ4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。 4.结果计算：

酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：

(A?B)?VT?17. 酶活(mgH2O2/gFW·min)=FW?V1?t

式中 A—对照KMnO4滴定毫升数； B—酶反应后KMnO4滴定毫升数； VT—酶液总量（ml）； V1—反应所用酶液量（ml）; W—样品鲜重（g）；

1.7—1ml 0.1mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2。 【注意】

所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。

四、植物叶绿素含量的测定（分光光度法）

一、原理

根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定

波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a 和b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。叶绿素a和叶绿素b的比值反映植物对光能利用效率的大小，比值高则大，比值小则反之。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。

（二）仪器设备：1）分光光度计；2）电子顶载天平（感量0.01g）；3）研钵；

4）棕色容量瓶； 5）小漏斗；6）定量滤纸；7）吸水纸； 8）擦境纸；9）滴管。 （三）试剂：1）95%乙醇（或80%丙酮）；2）石英砂；3）碳酸钙粉。

三、实验步骤

（1）取新鲜植物叶片（或其它绿色组织），擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。

（2）称取剪碎的新鲜样品 0.2g ，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml 95%乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。

（3）取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

（4）用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。

（5）把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm和645nm下测定吸光度。

四、（4）95%乙醇为空白对照，在645nm、663nm、652nm波长下测定光密度值。

1.3 计算方法

D663=82.04Ca +9.27Cb

D645=16.75Ca +45.6Cb (浓度单位：g/mL）

CA= 12.72D663 – 2.59D645 CB= 22.88D645 – 4.68 D663

CT = 20.29D645 +8.02D663 (浓度单位：mg/L） Chl(mg/g叶)= C(mg/L)*提取液总量（L）*稀释倍数/FW（g） 注意事项： （1）避光。

（2）时间控制，研磨以及放置时间不宜过长。 （3）叶绿素一定要提干净，以免造成误差。

叶绿素a、b的总含量 = 8.02?OD663 + 20.20?OD645

注意：1.叶绿素一定要提干净，避免造成测定误差 2.叶绿素初提液体积不要太多，以免浪费试剂，如果浓度太高可进行适当稀释

六、种子淀粉酶活性的测定