植物组织培养

一、实验目的

1、掌握植物细胞无菌培养技术。

2、了解不同激素对细胞的不同诱导作用。

二、实验原理

植物组织培养是20世纪60年代以来植物细胞生物学中发展起来的一项生物技术。它是借用无菌操作方法，培养植物的离体器官，组织或细胞，使其在人工合成的培养基上，通过细胞的分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整的再生植株。

植物组织培养技术的研究，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践中也已显示了广阔的应用前景。组织分化与形态建成问题，快速繁殖与去除病毒，花药培养与单倍体育种，幼胚培养与试管受精，抗体突变体的筛选于体细胞无体系变异，悬浮细胞培养与次生物质生产以及超低温种质保存等方面的深入研究与实际应用，都必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法，深刻理解植物细胞的全能性。

三、实验用品

1、材料

半夏无菌苗。 2、仪器

卧式灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养箱或培养室。 3、用具

镊子、刀、牛皮纸、marker笔、棉线。 4、器皿

试剂瓶(50、100、1000ml)、三角瓶(100ml)、刻度吸管(0.5、1、5、10ml)、培养皿(直径9～11cm)。 1、 药品与试剂

1).药品(见下表) 2).70％酒精

四、实验方法

1、培养基的配制

配制培养基前先要配制母液。母液分大量元素、微量元素、铁盐及有机物质四类。(各类成分浓度、用量详见下表)。

表1 MS培养基母液配制 (单位：mg)

类 别 大 量 KNO3 NH4NO3 成分 规定量 1900 1650 称取量 19000 16500 母液体积(ml) 扩大倍数 配1升培养基 的吸取量(ml) 100 1000 10

元 素 MgSO4·7H2O KH2PO4 CaCl2·2H2O MgSO4·4H2O ZnSO4·7H2O H3BO3 KI Na2MoO4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O Na2-EDTA FeSO4·7H2O 甘氨酸 盐酸硫胺素 盐酸吡哆素 烟酸 肌醇 370 170 440 22.30 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 37.25 27.85 2.0 0.4 0.5 0.5 100 3700 1700 4400 2230 860 620 83 25 2.5 2.5 3725 2785 100 20 25 25 5000 500 100 10 1000 100 10 1000 100 10 微 量 元 素 铁 盐 有 机 物 质 1).大量元素母液(10倍液)

分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800ml热的(60～80℃)蒸馏水中。一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水定容至1000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用。 2).微量元素母液(100倍液)

分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解于800ml重蒸水中，加水定容至1000ml。 3).铁盐母液(100倍液)

称取100倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸钠)和FeSO4·7H2O溶于800ml重蒸水中，最后定容到1000ml。

4).有机物质母液(100倍液)

分别称取50倍用量的各种有机物质，依次溶解于400ml重蒸水中，定容至1000ml，装入棕色试剂瓶中，贮存冰箱备用。

除了上述四种母液外，培养基中经常附加的各种生长素和细胞分裂素也要配成母液贮存，临用时按浓度定量吸取加入。 5).生长素

如2，4－D、IAA、NAA等。准确称取20mg，先用2ml 95％乙醇溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。 6).细胞分裂素

如激动素(Kt)、6-卞基嘌呤(6-BA)。准确称取20mg，先用2ml的1mol/L HCl或NaOH溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。 2、 1L培养基的配制与分装

1).取1000ml烧杯一只，加大量元素10倍母液100ml，微量元素100倍母液10ml，铁盐100倍母液10ml，有机物质100倍母液10ml。然后加水至800ml，加蔗糖30g，NAA终浓度0.25mg/L,6-BA0.75mg/L。待蔗糖充分溶解后用1mol/L的NaOH或HCl调酸碱度为pH5.8-6.0。

2).取一个250mL的烧杯，加200mL蒸馏水。煮沸后加8g琼脂条，待煮到一定境界后，液体为白色，

糊了就会有点偏黄，但液体中最好不要还可见条状的琼脂。煮琼脂时顺便把刚才的800mL液体也加热至50-60度，待琼脂煮好后再混合就能避免琼脂凝固。由于加热挥发，琼脂溶液少于200ml,混合后要定容至1L。分装到培养用三角瓶中，每只50ml三角瓶约装25ml培养基。分装时要避免把培养基倒在瓶口上，如果这样做了就用滤纸擦一擦，否则培养时容易引起杂菌污染。

3).把牛皮纸裁成适当大小的长方形，背靠背折起来，使成正方形，紧密裹在瓶口上，随后便可进行灭菌。

培养基的种类和附加成分是根据培养物的种类、外植体的来源以及具体的实验目的和要求来确定的。培养基中附加的蔗糖浓度均为0.8％(m/v)。 3、培养基的灭菌

把装好培养基的三角瓶放入高压灭菌锅中，盖好锅盖，我们此次用的是卧式灭菌锅，用法比较特别。首先最重要的是要确保水加够，然后放气阀为确保安全是一直开着的，先将旋钮打在关闭上，打开电源，当第一次加热的显示灯灭了之后，转换旋钮至灭菌，当第二次加热灯灭的时候，开始计时20min，然后关闭电源，打到慢排至压力降到0.05MPa再打到快排，降到0.02MPa后再换成全排，降至零后再换成关闭，打开盖子透气，让纸慢慢变干。放气过程有声音，所以也可以通过声音来判断是否该转换。 3、 超净台的操作

两小时前先用70%酒精擦拭超净台，擦好后关上挡风玻璃，按D打开紫外，接种前15分钟，关闭紫外，打开大风，稍微将挡风玻璃打开一点。 先在外面把手洗干净，然后在超净台内先用70％酒精浸泡过的棉球擦拭工作台的台面。放入培养瓶和接种工具，接种用的镊子、解剖刀、接种针及培养皿等可事前放入，点燃酒精灯，用酒精棉球擦拭手。把镊子、解剖刀、接种针灯插入盛70％酒精的广口瓶中。

取一瓶半夏的无菌苗，先将整瓶苗分装到各个培养皿内的吸水纸上以防交叉感染，吸干水后，把叶子切成3×5mm大的小片，打开三角瓶，把叶片投入瓶内，用接种针拨匀，重新盖上牛皮纸，扎上棉线。用记号笔在瓶壁上写明培养材料、培养基代号，标明接种日期。

全部接种工作都是在严格无菌条件下进行的，所以要特别认真、仔细、以防杂菌污染。 五、培养和观察

接种完毕后取出培养瓶，置26～28℃恒温培养箱室内，先暗处理三天再移置在光照条件下培养，定期进行观察。一般三天染细菌（长菌处有浑浊的液体），七天染真菌（长菌处有霉和普通的霉差不多）如有污染则弃之，培养3～4周后观察实验结果。

有兴趣的找小老师做胡萝卜。

五、实验结果

1、计算接种成功率(指没被污染的叶片数占总叶片的百分比)和诱导成功率(指诱导出细胞的叶片数占总叶片的百分比)。如果没有添加植物激素结果又会怎样？为什么？

2、人工条件下培养的植物离体器官、组织或细胞，经过分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整植株的过程说明什么问题？