miRNA定量PCR

1 miRNA 茎环反转录合成cDNA

（1）反转录引物设计：对成熟miRNA采用茎环反转录合成cDNA，在成熟miRNA的3’端使用一条50nt 可自行折叠成茎环结构的特异性RT 引物，序列如下：5`-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACNN-NNNN-3`，3’端的6个N代表与成熟 miRNA 3’端反相互补的6个碱基。

（2）反应体系：在0.2mlPCR反应管中加入，总反应体系为20μL：

5× First Strand synthesis Buffer 4 μL dNTP Mix 1 μL RNase Inhibitor（40 units/μl） 1 μ L Reverse Transcriptase（M-MLV） 1 μL Stem-loop RT Primer 1 μL Total RNA （终浓度500 ng） X μL RNase-free ddH2O 补至 20 μL Total volume 20 μL （3）反应条件：

Stage 1：将混匀的反应溶液置于65℃加热5min，之后放入冰中2min。 Stage 2：放置PCR仪里16℃热激30min，之后42℃ 60min，85℃，5min使酶失活停止反转录。

2 miRNA实时荧光定量qRT-PCR

（1）定量引物设计：反转录后cDNA产物的引物由一条特异性引物和一条通用引物组成，特异性引物基础序列于目标miRNA成熟序列互补，根据对引物的长度，Tm 值及GC含量的要求再用软件进行调整，可在 5’端加2-3个GC以增加退火温度，平衡GC含量，U6被作为内参序列。所有使用的引物序列被列在表3-1。

（2）应用SYBR染料法，对miRNA采用实时定量检测。反应体系参照SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）说明书，（反应液配制均在冰上进行）。

总反应体系为25μL：

SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ 12.5μL Specific Forward primer （10μM） 1 μL Universal Reverse primer （10μM） 1 μL cDNA 1st Strand 2μL ddH2O 8.5μL Total volume 2 5μL （3）Real Time PCR 反应程序： Stage 1：预变性95℃5min；

Stage 2：40循环：95℃5s，60℃30s

以上循环结束后进行65℃~95℃的融解曲线分析。为确保实验数据的有效性，每个样品平行三次，溶解曲线为单一峰。按照相对定量算法，目的基因的相对表达量计算公式为：Rel. Exp=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(处理样品ΔCt)-(CalibratorqΔCt)，处理样品ΔCt=(内参基因Ct)-(目的基因Ct)，CalibratorΔCt=(参比样内参基因Ct)–(参比样目的基因Ct)[i,ii]。

表3-1 miRNA stem-loop qRT PCR定量引物 Table 3-1 Primers used in stem-loop qR-PCR

Names

Primer

Sequence

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG

cam_miR159

RT primer Forward primer

cam_miR160

RT primer Forward primer RT primer

cam_miR164

Forward primer RT primer

cam_miR166

Forward primer RT primer

cam_miR171

Forward primer RT primer

cam_miR319

Forward primer RT primer

cam_miR390

U6-F U6-R

Forward primer

GTATTCGCACTGGATACGACTAGAGC-3' 5’-GCG CGT TTG GAT TGA AGG GA-3' 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACTGGCA-3' 5’-GCTGCCTGGCTCCCTGT-3'

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACTGCACG-3' 5’-GTCGTGGAGAAGCAGGGCA-3' 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACGGGGAA-3' 5’-GCG TCG GAC CAG GCT TCA-3' 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACGATATT-3' 5’-GCG TGA TTG AGC CGT GCC-3' 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACAGGGAG-3' 5’-GCG CTT GGA CTG AAG GGA G-3' 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACGGCGCT-3' 5’-GCT GAA GCT CAG GAG GGA T-3' 5’- AGACAATTGATGCGTGCGATC-3’ 5’- GCTGCAACTGCACTACCAAC-3’ 5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'

59.5 57.5 59.5 62.5

19 19 19 20

58 53 58 60

61.6

19

63

60.8

18

67

60.8

18

67

61.6

19

63

59.8

17

71

60.5

20

55

Tm

Length GC （%）

Universal Reverse primer

[i] Varkonyi-Gasic E, Wu R, Wood M, Walton EF, Hellens RP. Protocol: a highly sensitive

RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs[J]. Plant Methods. 2007. [ii] Caifu Chen, Dana A. Ridzon, Adam J. Broomer et al. Real-time quantification of microRNAs

by stem-loop RT-PCR[J]. Nucleic Acids Research. 2005, Vol. 33, No. 20:e179.