实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）数据处理

相对定量△CT 和2-△△CT方法

一、实时荧光原理及其中的概念

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）作为分子生物学实验中强大快速的一种检测手段，已经被广泛应用于临床和普通实验室。废话不多说，简单介绍一下其原理，和两个基本概念Ct（Cycle threshold）和扩增效率，然后详细解释一下相对基因定量的方法。 实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。qPCR中常用的荧光染料为SYBR Green I ，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，因此在PCR每个循环的延伸(双链 图2)过程中检测荧光信号，可以绘制原始的扩增曲线。如下图1： 图1：PCR扩增曲线 图2 ：双链发射荧光 n

Rn荧光信号量，n为循环数

扩增曲线可以分为：图3

1. 基线期 ：-荧光信号在最初的数个循环里变化不大，接近一条直线，称为基

线。

2. 对数期 ：-继基线之后，扩增进入到指数增长期，像细菌的繁殖曲线 3. 平台期 ：-随着扩增的循环增加,引物,dNTP的消耗殆尽,不会再有新的DNA链产生了,就进入到平台期了 图3 扩增曲线的分期

实时荧光PCR中重要的概念：CT 、扩增效率

CT值（Cycle threshold value）：实时荧光PCR过程中，扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环数。起始模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。

扩增效率E（efficiency）：理想的PCR反应在指数期应该是Rn=R0 * 2（Rn，

n次循环产物量。R0，初始模板量。n，循环次数） 因为每扩增一次PCR产物就会变为

n

上次的2倍。但是在实际PCR扩增中E基本在0.65-0.9。因此每个PCR反应的效率不一定都相同。因此，扩增公式可以写成 ：Rn= R0*（1+E） 二、2-△△CT数据处理的方法

基因定量包括绝对定量和相对定量。绝对定量就是标准曲线法，这里不详细

n

介绍，可以问度娘。绝对定量法比较费时费力，除了特殊情况，相对定量的方法也可以达到实验目的。在相对基因定量方法中，目前被广泛采用的就是2-△△CT法。用此方法有个前提，即目的基因（interest gene）和内参基因（endogenous control）有相同相近的扩增效率E。 扩增效率的推算： 1．公式法

1 Rn= R0*（1+E）○

n

1两边取对数： ○2 lgRn = lg (1+ E) ? n +lgR0 对○

2 ○3lgRct = lg (1+ E) ? CT +lgR0 n=CT时候 ○2可知 lgRn为Y轴 n为X轴 作图可以看到lg 2 的斜 由○(1+ E)即公式○

率S。

因此得到 E = 10-1

s