4. 微生物与人类基因组计划

生命科学

基础理论：分子遗传学，分子生物学

研究技术：动植物细胞培养 ，组织培养

基因组计划：模式生物（真核生物，酵母菌）

四、我国微生物学界面临的机遇和挑战

医学 工业 农业

生物工程学

遗传工程（主导） 获得工程菌（工程细胞工程 细胞柱） 微生物工程（发酵工程）（基础） 酶工程

生物反应器工程

获得产品

思 考 题：

? 试根据微生物的特点，谈谈为什么说微生物既是人类的敌人，更是人类的朋友。

? 为什么说巴斯德和柯赫是微生物学的真正奠基人？

第二章 微生物的纯培养和显微技术

微生物的基本特点：小！

在绝大多数情况下都是利用微生物的群体来研究其属性；

微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存； 培养技术在微生物学中具有重要意义！ 几个概念：

培养物：微生物学中，在人为规定的条件下培养繁殖得到的微生物群体称为培养物。 混合培养物：含有多种微生物的培养物； 纯培养物：只有一种微生物的培养物；

纯培养技术是进行微生物学研究的基础

微生物个体微小的特点决定了显微技术是进行微生物研究的一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。

第一节 微生物的分离和纯培养

从混杂的群体中分离特定的某一种微生物，是研究和利用微生物的第一步。

一、无菌技术

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用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染。

1、微生物培养的常用器具及其灭菌

常用的器具：试管、瓶子、培养皿等

常用的灭菌方法：高压蒸汽灭菌 高温干热灭菌 2、接种操作：无菌操作。

二、分离纯培养 培养基：液体培养基；

固体培养基； 半固体培养基；

1、用固体培养基分离纯培养 菌落（colony）：单个微生物在适宜的培养基表面或内部生长、繁殖到 一定程度可以形成肉

眼可见的、有一 定形态结构的子细胞生 长群体。

菌苔(lawn):当固体培养基表面众多菌落连成一片时便成为菌苔。

固体培养基分离方法

不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。 同一细菌在不同的培养基平板上形成不同特征的菌落。

固体培养基分离方法包括： 稀释倒平板 涂布平板法 平板划线法

厌氧微生物分离------稀释摇管法

不同形状的菌落

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菌落的培养特征2、 液体培养基分离方法---------稀释法

稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。

例如：若同一稀释度的试管中有95%表现为不生长，则 生长的试管中仅含一个细胞的几率为：4.8%； 含二个细胞的几率为：0.12%； 含三个细胞的几率为：0.002% 则：0。048/（0.048+0.0012+0.00002）=0.975

在有细菌生长的试管中得到纯培养的几率为97.5%

3、单细胞（孢子）分离

一般采用显微操作仪，在显微镜下进行 ? 操作难度与细胞或个体的大小成反比

? 单细胞（单孢子）分离:可以采取显微分离法从混杂 群体中直接分离单个细胞或单

个个体进行培养以获得纯培养

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4、选择培养分离

用于微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化：

原理：抑制大多数其它微生物的生长；使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物在

群落中的数量上升；使待分离的微生物生长“突出”，直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。

1） 利用选择平板进行直接分离：根据微生物的特点选择不同的培养条件，使待分离的

微生物生长，其它微生物的生长被抑制，或使待分离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物。

? 高温下培养：分离嗜热细菌； ? 培养基中不含N：分离固氮菌； ? 培养基加抗生素：分离抗性菌； ? 牛奶平板：分离蛋白酶产生菌； ? 颜色反应：分离特定的菌株；

? 利用特定细菌的滑动特点进行分离纯化；

2） 富集培养：利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使

仅适应于该条件的微生物旺盛生长，待分离微生物在群落中的数量大大增加，从自然界中分离到所需的特定微生物。

富集培养过程

利用该方法，可根据微生物的特殊要求，从自然界分离出特定已知微生物种类，分离培养在特定环境中能生长的微生物；

三、二元培养物

培养物中只含有二种微生物，而且是有意识地保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。

如：病毒和宿主细胞；纤毛虫、变形虫和粘细菌。

第二节 显微镜和显微技术

几个基本概念：放大：被观察物越小，放大倍数应越大，否则难以看清！ 分辨率：能辨别两点之间最小距离的能力 反差：被观察物区别于背景的程度 与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术，这就是显微技术。 一、显微镜的种类及原理

1. 普通光学显微镜

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光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？为什么？

目镜：10 ~ 15 ╳；物镜： 100 ╳；总放大倍数1000~1500 ╳； 如何实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数？其原理？

使用油镜，即在100 ╳物镜和载玻片之间滴加香柏油；

分辨率（最小可分辨距离）= 0.5λ /n sinθ

θ为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离 n：玻片与物镜间介质的折射率

空气 (n=1.0)、水 (n=1.33)、香柏油 (n=1.52)、玻璃 ( n=1.54)

显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质 用浸没油取代空气的作用：

介质折射率提高 → 数值孔径值和分辨率均得到提高

浸没油与玻璃的折射率相近→很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的 光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。

光学显微镜物镜的特性

物镜 特性 搜索物镜 低倍镜 高倍镜 油镜 放大倍数 4× 10× 40-45× 90-100× 数值孔径值 0.10 0.25 0.55-0.65 1.25-1.4 焦距（f） 40 mm 16 mm 4 mm 1.8-2.0 mm 工作距离 17-20 mm 4-8 mm 0.5-0.7 mm 0.1 mm 2.3 ?m 0.9 ?m 0.35 ?m 0.18 ?m 450nm光源（蓝 光）时的分辨率 人眼的分辨能力在0.2 mm左右，因此光学显微镜的最大有效放大倍数（使用油镜）是1,000×到1,500×

2. 暗视野显微镜 3. 相差显微镜

形成亮背景暗物象的结果 4. 荧光显微镜

5. 透射电子显微镜； 6. 扫描电子显微镜

能否用扫描电镜来观察样品的内部结构，而用透射电镜来观察样品的表面结构？ 7. 扫描隧道显微镜 二、显微观察样品的制备

光学显微镜的制样

1. 活体观察：压滴法、悬滴法、菌丝埋片法 1. 染色观察

原因： 加大反差，便于观察

细菌染色法：死菌：正染色：简单染色法

鉴别染色法：革兰氏染色法；抗酸性染色法；

姬姆萨染色法；芽孢染色法；

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