流式细胞术检测淋巴细胞表面标记

一、实验目的

1.了解流式细胞仪的组成、原理及应用：初步了解流式细胞仪的工作元件及基本应用原理；能够认识流式细胞术的应用，特别是常用的一些功能。

2. 熟悉用流式细胞术检测小鼠脾脏T细胞表面标志的基本流程

3. 学习并掌握流式细胞术结果的分析：能够基本看懂结果图，重点掌握“门”和“补偿”两个概念。

二、实验原理

1. 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性（多参数）的技术，同时可以对特定群体加以分选。

特点：可检测的样本种类多样，大小范围较广（0.2~50μm）；检测速度快，分析样本量大（快速、大量）；细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏；采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度10000个细胞(微粒)/秒与统计分析精确性。

2. 流式细胞仪组成及原理

Fluidics (液流系统)——流体动力学聚焦样本形成单细胞流。 鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。匀速流动，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。

Optics (光学系统)——激发和收集光信号。

激发系统包括：激光器、透镜和反射镜，将激光聚焦到检测区 收集系统包括：光学镜片和滤光片、光信号检测器 流式细胞仪收集的信号：（1）散射光信号：细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光(信号强弱与细胞体积大小成正比)和侧向散射光(检测细胞粒度和细胞内相对复杂性)。FS-SS图可对未染色的活细胞进行分析或分选，但不能分析表面分子（2）荧光信号：荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同；每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管；选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。

Electronics (电子系统)——数据处理系统，扩大信号，将光信号转化为电信号，处理信号并存储于电脑。

3.流式步骤 第一步：用带有不同荧光基团的抗体分别识别并结合细胞上不同抗原（染色）；第二步：带有荧光的细胞一个接一个通过激光；第三步：不同荧光基团有不同发射光谱，荧光染料选择原则：必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发、激发光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内、荧光素光谱的重叠应当尽量减少；第四步：复杂的荧光信号被不同分色镜和滤光片分解；第五步：光电倍增管（PMT）将光信号变成电信号；第六步：模数变换器（ADC）进一步将模拟信号变成计算机能处理的数字信号

4.分选基本原理

细胞悬液形成液流柱→压电晶体产生机械振动，流动室振动→液流断裂成液滴→如果为空白液滴，则不充电，弃去；如果为含细胞的液滴，则充电，偏转落入收集器。

5.门指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。根据门的形状又分为线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。

6.由于荧光波长会相互重叠，所以会出现只染了绿色荧光（FITC）的细胞，也会在橘黄色（PE）检测出信号，所以我们需要根据设各种单染管，调整每种荧光阴性群位置，凭观察判断调整补偿多少，使得类似PE与FITC的重叠比较少，

三、实验材料 单个核细胞 抗体：

CD3+ T cell FITC anti-mouse CD3 CD4+ T cell PE anti-mouse CD4 CD8+ T cell APC anti-mouse CD8a

CD3抗体、CD4抗体、CD8抗体按照1：200倍稀释作为工作浓度 吸管、试管、移液器、EP管 四、实验步骤

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1.收集细胞：取细胞总数约1x10-5x10脾脏细胞于1.5ml EP 管中（在管盖上标记好组别），1500rpm， 4℃，5min（离心机需预冷）

2.染色：小心用枪吸去上清，用100ul PBS重悬细胞，然后分别加入100ul含荧光抗体的PBS（注意做好标记），混匀，避光，4℃，20-30min。（此时管中抗体为1：400，即0.5μl/200μlPBS）

上机时共需使用五管——1.No stain、2. 三染管、3. 单染CD3、4. 单染CD4、 5. 单染CD8

3.清洗：加500ul PBS，吹打混匀后， 5000rpm， 4℃，5min 4.检测：小心用枪去除上清，再加入500ul PBS吹打混匀，转入流式管，置于冰上，流式细胞仪检测

五、实验数据处理和分析

图一根据细胞大小和折光分类，圈出了所有淋巴细胞，排除细胞碎片和杂质。图二横纵轴均为前向散射光，通过比较纵轴的面积大小，圈出单个细胞，排除粘连的细胞。

图三圈出了表面分子为CD3的细胞，即全部T细胞。图四的Q1区为CD8+CD4-T cell，Q3区为CD4+CD8-T cell，Q4区为CD4-CD8-Tcell，Q2区为CD4+CD8+T cell。

如图可看出，CD4+T cell含量为69.5%，CD8+T cell为21.4%，CD4+/CD8+ 比例约为3.2，查阅得Balb/c小鼠的CD4+/CD8+ 比例约在2-3范围内，所以我认为实验结果属正常情况。

六、思考

T细胞比例在临床检测中的意义？

人体CD4+/CD8+比值正常情况下为1.4-2.0，升高或降低均与疾病相关。 升高——

常见于自身免疫性疾病中，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、Ⅰ型糖尿病等，此外还可用于监测器官移植的排斥反应，若移植后CD4+/CD8+比值明显升高，则可能发生排异反应。

减小——

CD4+/CD8+比值减小是免疫缺陷病的重要指征。在获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者中，就存在着CD4+细胞数显著减少的现象

此外，CD4+／CD8+比值的严重减小甚至倒置被认为是病毒感染性疾病的重要指征：在水痘、猩红热、麻疹患者中就发现有CD3+、CD4+细胞数减少，CD8+细胞数增多，CD4+/CD8+比值降低。

急性期和复发的传染性单核细胞增多症中也有CD4+／CD8+比值降低的现象，它是由CD8+细胞数增高引起的。

骨髓造血细胞的增殖和分化障碍也可造成CD4+／CD8+比值降低，如在再生障碍性贫血与粒细胞减少症中，患者体内外周血CD4+细胞数减少，导致CD4+／CD8+比值明显下降。

CD4+/CD8+比值与肿瘤也相关：实体瘤患者像消化道癌症、肝癌、乳腺癌患者外周血中都有CD3+、CD4+细胞数降低，CD8+细胞数增多，CD4+／CD8+比值明显降低的现象。