蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH 达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。

本实验借观察在不同pH 溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH即为酪蛋白的等电点。 三、 实验器材

水浴钠、温度计、200ml锥形瓶、100mL容量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵

四、 实验试剂

1、0.5%酪蛋白醋酸钠溶液 200mL

取纯酪蛋白（干酪素）0.05 g加蒸馏水20mL及1mol/LNaOH溶液5mL，混合使之溶解，再加1mol/L HAc溶液5mL，定容至50mL即可。 2、1.00mol/L醋酸溶液 100mL

3、0.10mol/L醋酸溶液 100mL 4、0.01mol/L醋酸溶液 50mL

五、 实验操作 1） 试 剂 编 号 1 2 3 4 5 pI 4.19 4.37 4.0 2.5 3.7 蒸馏水 （mL） 0.01mol/L 醋酸 (mL) 0.31 — — — — 0.1mol/L 醋酸 (mL) — 0.13 0.5 2.0 — — — — — 0.8 5.9 5.3 4.7 4.1 3.5 1.0mol/L 醋酸 (mL) pH 取同样规格的试管5支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。

2) 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4、5管的pH依次为5.9、5.3、4.7、4.1、3.5。

观察其混浊度，静置10分钟，再观察其混浊度。最混浊的一管即为酪蛋白的等电点。

实验十四、酶的性质

一、实验目的

1.通过本实验观察、验证酶的专一性和温度、pH、激动剂及抑制剂对酶活性的影响。

2.熟悉淀粉及其酶解产物的特殊显色方法；电热恒温水浴的使用。 3.了解唾液淀粉酶的收集与预处理。

二、实验原理

酶具有高度专一性，一种酶只能催化一种或一类底物发生反应，如淀粉酶只能水解淀粉，不能水解蔗糖。当淀粉被淀粉酶彻底水解为还原性麦芽糖和葡萄糖时，能使班氏试剂的Cu2+还原成Cu1+，生成砖红色Cu2O沉淀。淀粉酶的活性受温度、pH、激动剂及抑制剂、酶浓度以及作用时间等多种因素影响，因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。不同程度的水解糊精可与碘反应生成紫色、棕色或红色络合物。通过上述特征性反应，并以蔗糖等作对照，便可观察、验证淀粉酶是否具有专一性以及它的催化活性是否受到影响。 三、试剂和器材 （一）、器材

1、滴管、烧杯、试管（架）及试管夹 。 2、恒温水浴箱与水浴锅。 3、脱脂棉、漏斗及纱布。 4、白瓷反应盘 （二）试剂

1、1％淀粉 称取淀粉1g，加少量水调成糊状，加入煮沸的0.3％NaCl溶液至100m1。

2、1％蔗糖溶液

3、班氏试剂 A液：取柠檬酸钠173ｇ，无水碳酸钠100ｇ，加水600ml，加热溶解，冷却后稀释至850ml；B液：取结晶硫酸铜（CuSO4·5H2O）17.3ｇ溶于100ml预热的蒸馏水中，冷却后加水至150ml。将A液缓慢倒入B液中混匀置试剂瓶备用。

4、碘液：称取碘4g、碘化钾6g溶于l000ml蒸馏水中，置棕色瓶内贮存备用。

5、各种pH缓冲液

（1）pH6.8缓冲液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液772ml，0.1mol/L柠檬酸溶液228ml混合即成。

（2） pH4.0缓冲液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液385.5ml，0.1mol/L柠檬酸溶液614.5ml混合即成。

（3）pH8.0缓冲液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液972ml，0.1mol/L柠檬酸溶液28ml混合即成。

6、0.9％ NaCl 溶液 7、1％CuSO4 溶液 8、1％Na2SO4溶液 四、操作步骤

（一）、唾液淀粉酶的收集与处理 1.制备唾液

实验者先将痰咳尽，用自来水漱口，以清除口腔内食物残渣，再在口腔内含蒸馏水约15ml，并作咀嚼咕漱运动，3分钟后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱布的漏斗内，过滤于小烧杯中备用，为与下面稀释唾液相区别，此称制备唾液。 2.煮沸唾液

取上述唾液约2ml，盛入1中号试管中,置沸水浴煮沸5分钟备用。 3.稀释唾液

调整唾液淀粉酶活性，使之在pH6.8、37℃和既无激动剂又无抑制剂条件下，作用5min，水解淀粉至红色糊精为宜。具体做法是取12凹白瓷反应板一块，按下列步骤操作：

①第1排每凹各加1滴制备唾液，12、13、14凹分别加生理盐水1、2、3滴，用滴管采用抽吸法，由稀到浓（14→12）小心混匀各凹，勿使溅入相邻凹中。每混匀一凹便取其1滴放入同列的2排凹中，剩余稀释唾液应全部放回原凹中。 ②在盛有不同稀释度唾液的第2排各凹中，均加入4滴缓冲液（pH6.8），2滴1%的淀粉液和2滴蒸馏水，用①混匀法充分混匀，置37℃下5min。

③在第2排各凹中加I液一滴，混匀，观察比较各凹颜色，以浅棕-红色对应的稀释倍数，用生理盐水稀释3ml制备唾液备用。

（二）唾液淀粉酶的专一性以及温度、pH、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活性影响的观察

1、取试管3支编号，按下表1操作

表1 唾液淀粉酶专一性的实验观察

试剂 试管

pH6.8缓冲液 1％淀粉溶液

1％蔗糖溶液 制备唾液

煮沸唾液

1 2 3

20滴 20滴 20滴

10滴 10滴 －

－ － 10滴

5滴 － 5滴

－ 5滴 －

将上述各管混匀后，置37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入班氏试剂20滴，再放入沸水浴中煮沸约15分钟，观察各管颜色反应，并说明原因。

（三）温度影响酶促反应的实验观察 1.取试管3支编号，按下表2操作：

表2 温度影响酶促反应的实验观察

管号 试剂 1.pH6.8缓冲液 2.1％淀粉溶液 3.预热5min 4.直接加入稀释唾液，立即混匀、计时 5.保温10min 1 20滴 10滴 37℃水浴 5滴 37℃水浴 2 20滴 10滴 沸水浴 5滴 沸水浴 3 20滴 10滴 冰浴 5滴 冰浴 2.将一、二管移入冰水浴中，待各管温度一致后速向各管加入碘液1滴，混匀后观察各管颜色的区别，并说明温度对酶促反应的影响。

（四）、pH影响酶促反应的实验观察 1. 取试管3支编号，按下表3操作：

表3 pH影响酶促反应的实验观察

pH4.0缓冲液 pH6.8缓冲液 pH8.0缓冲液 1％淀粉溶稀释唾液

液

试管1 试管2 试管3

20滴 － －

－ 20滴 －

－ － 20滴

10滴 10滴 10滴

5滴 5滴 5滴

2.将上述各管混匀后，置37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入碘液1滴，混匀后观察各管颜色的区别，并说明pH对酶促反应的影响。