9.凝胶过滤层析和凝胶电泳中的分子筛效应有什么不同？为什么？

答：凝胶过滤层析中每一个凝胶珠相当于一个分子筛，故小分子所经过的路径长，落在大分子后面；而凝胶电泳中整块胶板相当于一个分子筛，故大分子受到的阻力大而迁移慢，落在小分子后面。

10.配制一系列牛血清清蛋白（BSA）稀释液，每一种溶液取0.1ml进行Bradford法测定。对适当的空白测定595nm波长处的光吸收（A595）。结果如下表所示：

BSA浓度（mg·L）

1.5

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2

-1

A595 1.4 0.97 0.79 0.59 0.37 0.17

BSA浓度对A595作图得标准曲线。E.coli的蛋白质提取液样品（0.1ml）测得的A595为0.84。根据标准曲线算出E.coli提取液中的蛋白质浓度。[0.85mg/ml]

解：标准曲线略。由标准曲线可知，当A595为0.84时，BSA浓度为0.85mg/ml。

第八章 酶通论

提要

生物体内的各种化学变化都是在酶催化下进行的。酶是由生物细胞产生的，受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。与一般催化剂相比有其共同性，但又有显著的特点，酶的催化效率高，具有高度的专一性，酶的活性受多种因素调节控制，酶作用条件温和，但不够稳定。

酶的化学本质除有催化活性的RNA分子之外都是蛋白质。根据酶的化学组成可分为单纯蛋白质和缀合蛋白质两类。缀合蛋白质是由不表现酶活力的脱辅酶及辅因子（包括辅酶、辅基及某些金属离子）两部分组成。脱辅酶部分决定酶催化的专一性，而辅酶（或辅基）在酶催化作用中通常起传递电子、原子或某些化学基团的作用。

根据各种酶所催化反应的类型，把酶分为六大类，即氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。按规定每种酶都有一个习惯名称和国际系统名称，并且有一个编号。

酶对催化的底物有高度的选择性，即专一性。酶往往只能催化一种或一类反应，作用于一种或一类物质。酶的专一性可分为结构专一性和立体异构专一性两种类型。用“诱导契合说”解释酶的专一性已被人们所接受。

酶的分离纯化是酶学研究的基础。已知大多数酶的本质是蛋白质，因此用分离纯化蛋白质的方法纯化酶，不过要注意选择合适的材料，操作条件要温和。在酶的制备过程中，每一步都要测定酶的活力和比活力，以了解酶的回收率及提纯倍数，以便判断提纯的效果。酶活力是指在一定条件下酶催化某一化学反应的能力，可用反应初速率来表示。测定酶活力及测酶反应的初速率。酶活力大小来表示酶含量的多少。

20世纪80年代初，Cech和Altmsn分别发现了某些RNA分子具有催化作用，定名为核酶（ribozyme）。有催化分子内和分子间反应的核酶。具有催化功能RNA的发现，开辟了生物化学研究的新领域，提出了生命起源的新概念。根据发夹状或锤头状二级结构原理，可以设计出各种人工核酶，用作抗病毒和抗肿瘤的防治药物将会有良好的应用前景。

抗体酶是一种具有催化能力的蛋白质，本质上是免疫球蛋白，但是在易变区赋予了酶的属性。根据酶催化的过度态理论，设计各种过度态类似物作为半抗原免疫动物，筛选具有催化活性的单抗。抗体酶具有酶的一切性质。现已研制出催化多种反应的抗体酶。抗体酶的发现，不仅为酶的过度态理论提供了有力的实验证据，而且抗体酶将会得到广泛的应用。

酶工程是将酶学原理与化学工程技术及基因重组技术有机结合而形成的新型应用技术，是生物工程的

21

支柱。根据研究和解决问题的手段不同将酶工程分为化学酶工程和生物酶工程。随着化学工程技术及基因工程技术的发展，酶工程发展更为迅速，必将成为一个很大的生物技术产业。

习题

1.酶作为生物催化剂有哪些特点？

答：酶是细胞所产生的，受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂，与一般非生物催化剂相比较有以下几个特点：1、酶易失活；2、具有很高的催化效率；3、具有高度专一性；4、酶活性受到调节和控制。

2.何谓酶的专一性？酶的专一性有哪些？如何解释酶作用的专一性？研究酶的专一性有何意义？

答：酶的专一性是指酶对催化的反应和反映物有严格的选择性。酶的专一性分为两种类型：1、结构专一性，包括绝对专一性、相对专一性（族专一性或基团专一性、键专一性）；2、立体异构专一性，包括旋光异构专一性、几何异构专一性。

通过对酶结构与功能的研究，确信酶与底物作用的专一性是由于酶与底物分子的结构互补，诱导契合，通过分子的相互识别而产生的。

对酶的专一性研究具有重要的生物学意义。它有利于阐明生物体内有序的代谢过程，酶的作用机制等。

3.酶的活性受那些因素调节，试说明之。

答：酶的调节和控制有多种方式，主要有：

（1） 调节酶的浓度：主要有2种方式：诱导或抑制酶的合成；调节酶的降解；

（2） 通过激素调节酶活性、激素通过与细胞膜或细胞内受体相结合而引起一系列生物学效应，以

此来调节酶活性；

（3） 反馈抑制调节酶活性：许多小分子物质的合成是由一连串的反应组成的，催化此物质合成的

第一步的酶，往往被他们终端产物抑制；

（4） 抑制剂和激活剂对酶活性的调节：酶受大分子抑制剂或小分子物质抑制，从而影响酶活性； （5） 其他调节方式：通过别构酶、酶原的激活、酶的可逆共价修饰和同工酶来调节酶活性。

４.辅基和辅酶有何不同？在酶催化反应种起什么作用？

答：辅酶通常指与脱辅酶结合比较松弛的小分子有机物质。通过透析方法可以除去，如辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ等。辅基是以共价键和脱辅酶结合，不能通过透析除去，需要经过一定的化学处理才能与蛋白分开，如细胞色素氧化酶中的铁卟啉，丙酮氧化酶中的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）都属于辅基。它们的区别只在于它们与脱辅酶结合的牢固程度不同。辅酶、辅基在酶催化反应中通常是起着电子、原子或某些化学基团的传递作用。

５.酶分哪几大类？举例说明酶的国际系统命名法及酶的编号。

答：国际酶学委员会根据酶所催化反应的类型，把酶分为６大类：即氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。分别利用1、2、3、4、5、6来表示。例如：1.1.3表示氧化还原酶，作用于CHOH基团，受体是分子氧。根据底物中别所用的基团或键的特点将每一大类分为若干亚类，每一个亚类又按顺序变成1、2、3??等数字；每一个亚基可再分亚亚类，仍用1、2、3??编号，每一个酶的分类编号由4个数字组成，数字间由由“·”隔开。第一个数字指明该酶属于哪一个大类；第二个数字指明酶属于哪一个亚类；第三个数字指出该酶属于一个亚亚类；第四个数字则表明该酶在亚亚类中的排号。编号之间冠以EC（Enzyme Commision）。

6.什么叫酶的活力和比活力？测定酶活力应注意什么？为什么测定酶活力时以测定初速率为宜，并且底物浓度远远大于酶浓度？

答：酶活力指酶催化某一化学反应的能力，其大小可用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示；酶的比活力代表酶的纯度，根据国际酶学委员会的规定比活力用每mg蛋白质所含的酶活力单

22

位数表示。

酶的催化作用受测定环境的影响，因此测定酶活力要在最适条件下进行，即最适温度、最适pH、最适底物浓度和最适缓冲离子强度等。只有在最适条件下测定才能真实反映酶活力的大小。

随时间的延长，酶促反应中底物浓度降低，产物浓度增加，加速逆反应的进行，产物对酶抑制或激活作用以及随时间的延长引起酶本身部分分子失活等，酶促反应速率降低，因此测定活力，应测定酶促反应的初速率，从而避免上述种种复杂因素对反应速率的影响。

底物浓度太低时，5%以下的底物浓度变化实验上不易测准，所以在测定酶的活力时，往往使底物浓度足够大，这样整个酶反应对底物来说是零级反应，而对酶来说却是一级反应，这样测得的速率就比较可靠地反映酶的含量。

7.什么叫核酶和抗体酶？它们的发现有什么重要意义？

答：具有催化功能的RNA叫核酶。它的发现，表明RNA是一种既能携带遗传信息又有生物催化功能的生物分子。因此很可能RNA早于蛋白质和DNA，是生命起源中首先出现的生物大分子，而一些有酶活性的内含子可能是生物进化过程中残存的分子“化石”。酶RNA的发现，提出了生物大分子和生命起源的新概念，无疑促进对生物进化和生命起源的研究。

抗体酶是20实际80年代后期才出现的一种具有催化能力的蛋白质，其本质上是免疫球蛋白，但是在易变区被赋予了酶的属性，所以又称“催化性抗体”，抗体酶的发现，不仅为酶的过渡态理论提供了有力的实验证据，而且抗体酶将会得到广泛的应用。

8.解释下列名词：

（1） 生物酶工程：酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。

（2） 固定化酶：将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的、但仍具有酶活性的状态。 （3） 活化能：在一定温度下1mol底物全部进入活化状态所需要的自由能（kJ/mol） （4） 酶的转化数：在一定条件下每秒钟每个酶分子转换底物的分子数。 （5） 寡聚酶：由两个以上亚基组成的酶。

（6） Kat单位：在最适条件下，每秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量，为Kat单位。

（7） 酶偶联分析法：由于分光光度法有其独特的优点，因此把一些原来没有光吸收变化的酶反应，可

以通过与一些能引起光吸收变化的酶反映偶联使第一个酶反应的产物转变成第二个酶的具有光吸收变化的产物来进行测量。

（8） 诱导契合说：1958年Koshland提出，当酶分子与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子诱导，其构

象发生有利于底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补契合进行反应。

（9） 反馈抑制：许多小分子物质的合成是由一联串的反应组成的，催化此物质生成的第一步的酶，往

往被它们终端产物抑制。这种抑制叫反馈抑制。

（10） 多酶复合体：由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成。

9.用AgNO3对在10ml含有1.0mg/ml蛋白质的纯酶溶液进行全抑制，需用0.342μmol AgNO3，求该酶的最低相对分子质量。

-3-6

解：Mr=10×10/0.342×10=29240Da

3

10.1μg纯酶（Mr:92×10）在最适条件下，催化反应速率为0.5μmol/min，试计算：（1）酶的比活力。

-1

[500U/mg]（2）转换数。[766.7s] 解：（1）比活力=0.5μmol/min/1μg=500U/mg

3-1

（2）转换数=0.5/60÷[1/（92×10）]=766.7s

4-1

11.1g鲜重的肌肉含有40单位的某种酶，其转换数为6×10min，试计算该酶在细胞内浓度（假设新鲜组

-7

织含水80%，并且全部在细胞内）。[8.33×10 mol/L]

-643-7

解：[10/（6×10)]×40÷[（1×80%）/10]=8.33×10 mol/L

23

3

12.焦磷酸酶可以催化焦磷酸水解或磷酸，其相对分子质量为120×10，由6个相同亚基组成。纯酶的Vmax为2800U/mg酶。它的一个活力单位规定为：在标准测定条件下，37℃、15min内水解10μmol焦磷酸所需

-5

要的酶量。问：（1）每mg酶在每秒钟内水解多少mol 底物？[3.11×10mol]。（2）每mg酶中有多少mol

-8

的活性部位（假设每个亚基上有一个活性部位）？[5×10mol活性中心]。（3）酶的转换数是多少？[622s-1或622mol焦磷酸/（s·mol）酶活性中心]

-6-5

解：（1）2800×[（10×10）/（15×60）]=3.11×10 mol

-33-8

（2）（1×10）/（120×10）×6=5×10 mol

-5-33

（3）{（3.11×10）/[（1×10）/（120×10）]}/6=622

13.称取25mg蛋白酶粉配制成25ml酶溶液，从中取出0.1ml酶液，以酪蛋白为底物，用Folin-酚比色法测定酶活力，得知每小时产生1500μg酪氨酸。另取2ml酶液，用凯氏定氮法测得蛋白氮为0.2mg，若以每分钟产生1μg 酪氨酸的酶量为1个活力单位计算，根据以上数据，求出：（1）1ml酶液中所含蛋白质量及活力单位。[0.625mg蛋白质，250U]（2）比活力。[400U/mg蛋白质]（3）1g酶制剂的总蛋白含量及

5

总活力。[0.625g，2.5×10U] 解：（1）（0.2×6.25）/（2×25/25）=0.625mg （1500/60）/（0.1×25/25）=250U （2）250/0.625=400U/mg

33

（3）[0.625/（1×25/25）]×10= 0.625×10mg=0.625g

35

[（1500/60）/（0.1×25/25）]×10=2.5×10U

14.有1g淀粉酶酶制剂，用水溶解成1000ml，从中取出1ml测定淀粉酶活力，测知每5min分解0.25g淀粉。计算每g酶制剂所含淀粉酶活力单位数？[3000U]（淀粉酶活力单位定义：在最适条件下每小时分解1g淀粉的酶量称为1个活力单位） 解：（0.25×60/5）/（1/1000）=3000U

15.某酶的初提取液经过一次纯化后，经测定得到下列数据：试计算比活力、百分产量及纯化倍数。[比活力：180U/mg蛋白质，百分产量：17%，纯化倍数：9倍]

初提取液 （NH4）2SO4盐析 体积/ml 120 5 活力单位/（U/ml） 200 810 蛋白质/（mg/ml） 10 4．5 解：（1）810/4.5=180U/mg

（2）810×5÷（200×120）×100%=17% （3）180÷（200/10）=9

第九章 酶促反应动力学

提要

酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响此速率各种因素的科学。它是以化学动力学为基础讨论底物浓度、抑制剂、pH、温度及激活剂等因素对酶反应速率的影响。化学动力学中在研究化学反应速率与反应无浓度的关系时，常分为一级反应、二级反应及零级反应。研究证明，酶催化过正的第一步是生成酶-底物中间产物，Michaelis-Menten根据中间产物学说的理论推导出酶反应动力学方程式，即Km、Vmax、kcat、kcat/Km。Km是酶的一个特征常数，以浓度为单位，Km有多种用途，通过直线作图法可以得到Km

-1

及Vmax。Kcat称为催化常数，又叫做转换数（TN值），它的单位为s，kcat值越大，表示酶的催化速率

24

越高。kcat/Km常用来比较酶催化效率的参数。酶促反应除了单底物反应外，最常见的为双底物反应，按其动力学机制分为序列反应和乒乓反应，用动力学直线作图法可以区分。

酶促反应速率常受抑制剂影响，根据抑制剂与酶的作用方式及抑制作用是否可逆，将抑制作用分为可逆抑制作用及不可逆抑制作用。根据可逆抑制剂与底物的关系分为竞争性抑制、非竞争性抑制及反竞争性抑制3类，可以分别推导出抑制作用的动力学方程。竞争性抑制可以通过增加底物浓度而解除，其动力学常数Kˊm变大，Vmax不变；非竞争性抑制Km不变，Vˊmax变小；反竞争性抑制Kˊm及Vˊmax均变小。通过动力学作图可以区分这3种类型的可逆抑制作用。可逆抑制剂中最重要的是竞争性抑制，过度态底物类似物为强有力的竞争性抑制剂。不可逆抑制剂中，最有意义的为专一性Ks型及kcat型不可逆抑制剂。研究酶的抑制作用是研究酶的结构与功能、酶的催化机制、阐明代谢途径以及设计新药物的重要手段。

温度、pH及激活剂都会对酶促反应速率产生重要影响，酶反应有最适温度及最适pH，要选择合适的激活剂。在研究酶促反应速率及测定酶的活力时，都应选择酶的最适反应条件。

习题

1.当一酶促反应进行的速率为Vmax的80%时，在Km和[S]之间有何关系？[Km=0.25[S]] 解：根据米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S])得：

0.8Vmax=Vmax[S]/(Km+[S]) Km=0.25[S]

-2

2.过氧化氢酶的Km值为2.5×10 mol/L，当底物过氧化氢浓度为100mmol/L时，求在此浓度下，过氧化氢酶被底物所饱和的百分数。[80%]

-3-2-3

解：fES=[S]/（Km+[S]）=100×10/(2.5×10+100×10)=80%

3.由酶反应S→P测得如下数据：

[S]/molL 6.25×10

-5

7.50×10

-4

1.00×10

-3

1.00×10

-2

1.00×10

-5

-1

-1

-6-1

V/nmolLmin

15.0 56.25 60.0 74.9 75.0

-1-1

（1） 计算Km及Vmax。[Km：2.5×10，Vmax：75 nmolLmin]

-5-1-1

（2） 当[S]= 5×10 mol/L时，酶催化反应的速率是多少？[50.0 nmolLmin]

-5-1-1

（3） 若[S]= 5×10 mol/L时，酶的浓度增加一倍，此时V是多少？[100 nmolLmin] （4） 表中的V是根据保温10min产物生成量计算出来的，证明V是真正的初速率。 解：（1）Lineweaver-Burk双倒数作图法，或由米氏方程得：

-6-6-4-4

15=Vmax·6.25×10/ (Km+6.25×10)??① 60=Vmax·10/（Km+10）??②

-5-1-1

由①、②得：Km=2.5×10，Vmax=75 nmolLmin

-5-5-5-1-1

（2）V=75×5×10/（2.5×10+5×10）=50.0 nmolLmin

-1-1

（3）50×2=100 nmolLmin

-9-6

（4）底物转化量：（15．0×10×10）/（6.26×10）=0.024=2.4% < 5% ，故可证明。

-5-1-1-1-4-1

5.某酶的Km为4.7×10 molL，Vmax为22μmolL min，底物浓度为2×10 molL。试计算：（1）竞

-4-1

争性抑制剂，（2）非竞争性抑制剂，（3）反竞争性抑制剂的浓度均为5×10 molL时的酶催化反映速率？

-4-1-1-1

这3中情况的Ki值都是3×10 molL，（4）上述3种情况下，抑制百分数是多少？[（1）13.54μmolL min，

-1-1-1-1

24%；（2）6.68μmolL min，62.5%；（3）7.57μmolL min，57.5%] 解：（1）竞争性抑制剂的米氏方程为：V=Vmax[S]/(Km(1+[I]/Ki)+[S])

-1-1

代入数据得：V=13.54μmolL min

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