动物遗传学实验指导书
延边大学农学院
实验一 牛微量血细胞培养（全血培养）及染色体制片
一、原理：在正常情况下，哺乳动物的外周血中是没有分裂相的。但在植物凝集素(phytonemagglutininp HA)的作用下采集的血细胞进行短期培养，可获得丰富的具有分裂相的淋巴母细胞。在有丝分裂的中期，染色体缩短到比较固定的状态，适宜进行染色体形态和数目的观察。用人为的化学方法，使细胞分裂停止于有丝分裂的中期，以利于观察染色体。
二、目的：掌握体外的细胞培养法和用其制取哺乳动物染色体标本的技术。用体外细胞培养法制取染色体标本是制取家畜染色体标本的最主要的常用的方法，是细胞遗传学中的最重要的研究手段之一。
三、器材和试剂
采血管、采血针、卡介苗注射器、吸管培养瓶、V型离心管、试管架、染色缸、载玻片、酒精灯、计数器、盖玻片、标本盒、计时器、培养箱、离心机、酸度计、胶卷、剪子、干燥器、显微镜。
细胞培养基：199（或 Eagles MEM PMI 1640）
犊牛血清、植物血球凝集素（PHA）、青霉素、链霉素、4%碳酸氢钠、肝素（生理盐水配成500单位/毫升），秋水仙素50ug/ml、0.075M氯化钾、氯化钠、甲醇、乙醇、冰醋酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、姬姆萨染色液、二甲苯、香柏油、加拿大树胶、盐酸。
四、实验步骤与方法
1、采血：用经肝素湿润的10毫升注射器（或采血管）从静脉采血5毫升。
2、培养：在5毫升培养液中，依次加入10%犊牛血清，0.1毫升PHA，加适量青、链霉素，然后加入0.5毫升牛血清。轻轻混匀后，在37℃培养箱中培养72小时。
3、秋水仙素处理：在培养终止前2小时，加一滴秋水仙素（50r/ml），以使细胞抑制在分裂中期，摇匀后继续培养一段时间即可进行染色体制片。
4、低渗处理：用吸管温和吹打细胞悬液，移入V型离心管中1000rpm离心5分钟，弃去上清液，加入5毫升0.075MKCL（预热37℃），用吸管充分搅匀，放置15分钟。
5、固定：加入4毫升卡尔诺固定液（冰醋酸：甲醇=1：3）充分搅匀，1000转/分离心5分钟，弃去上清液，留沉淀物。
6、滴片：
（1）、离心管沉淀物中加入少量固定液，搅匀制成细胞悬液。
（2）、将预先泡在酒精加5%盐酸的广口瓶里的载玻片取出，用纱布擦干后，吹哈气使玻片上形成薄雾，然后马上滴悬液，并迅速移到酒精灯火焰上过一次，玻片上蓝火熄灭时，悬
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液就铺成一层薄膜。
7、染色：
（1）、配制染液：用缓冲液（1升加入磷酸二氢钾9.08 克、磷酸氢二钠49.50克，PH=6.8）配制成2%姬姆萨染色液。
（2）、把铺片先放入甲醇液后，迅速移到盛有染液的染色缸中放置10分钟，水洗。 8、镜检：先用低倍镜（×200-×400）下找出比较清晰而分裂相较好的染色体，然后用高倍镜（×1000-×5000）下详细观察染色体数目、形态，最后选择最好的分裂相进行显微镜摄影。
9、核型分析：将各条染色体从放大照片中剪下来，按同源染色体的相对长度，着丝点的位置等特征进行配对，并依次排队；常染色体从大到小依次排列；性染色体最后另排列。贴在硬纸壳上再摄影。
五、作业
1、简写全血培养及染色体制片的程序，并说明一些试药的作用和实验原理。 2、整理出核型分析结果。
实验二 小白鼠骨髓细胞染色体制片（直接法）
一、原理：染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。在骨髓细胞中，有丝分裂的指数是相当高的，因此可以直接得到中期细胞而不必象血淋巴细胞或其它组织那样要经过体外培养，主要的中期相来自于细胞系统，也来自于各种骨髓细胞。以骨髓为材料进行染色体研究的优点是不需要培养，细胞数目越多，分裂数目高，并能真实反映体内真实情况。
直接制片法，是直接从骨髓中取出细胞，经压片法或空气干燥法制片。为了提高有丝分裂的指数，在动物实验时，可在取材前经腹胚注射有丝分裂的抑制剂，一般常用秋水仙素。
二、目的：掌握采用直接法制作动物染色标本的步骤与方法。 三、器材、试剂：
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卡介苗注射器、针头（5号）、V型离心管、吸管、试管、试管架、显微镜、小白鼠、解剖器具（剪刀、镊子）、酒精灯。秋水仙素、0.075M氯化钾、甲醇、乙醇、冰醋酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、盐酸、姬姆萨染色液、二甲苯、香柏油、加拿大树胶。
四、实验步骤与方法
1、秋水仙素处理：先给小白鼠腹膛内注射秋水仙素（50r/ml）0.2毫升经1~2小时后致死。 2、摘取组织：用眼科剪子摘取股骨，剥离肌肉后剪掉股骨两端膨大的关节头，使其露出骨髓腔。
3、采集细胞：先用镊子夹住股骨，放在离心管口上方，然后用已抽吸少量0.075M氯化钾的卡介苗注射器，由上端轻轻地注入给骨髓腔，冲净细胞，再加入氯化钾至５毫升刻度为止。
4、低渗处理：用吸管充分搅匀后，静置１５分钟进行低渗处理。1000rpm离心５分，吸去上清液。
5、固定：沿管壁加５毫升新鲜卡尔诺固定液，马上散细胞团，使其在固定液中悬浊均匀。1000rmp离心５分，去上清液，即第一次固定。同样方法固定三次，留沉淀。
6、滴片：
（1）、在离心管底细胞团中再加少量（0.5ml）新鲜固定液，搅匀制成细胞悬浊液。 （2）、将预先泡在无水酒精加2%盐酸的广口瓶里的载玻片取出，用纱布擦干后吹哈气，使形成薄雾，立即滴悬浊液1~2滴，并迅速移到酒精灯上过一次，玻片上蓝火熄灭时，悬浊液就铺一层薄膜。
7、姬姆萨染色
（1）、配制染液：用缓冲液（1升蒸馏水加磷酸二氢钾9.08克、磷酸氢二钠 9.50克 PH=6.8）配成2%姬姆萨染色液。
（2）、先把铺片放入甲醇后，迅速移到盛有染液的染色缸中放置10分，然后水洗。 8、镜检：先用低倍镜（×200-×400）找出比较清晰而分裂相较好的染色体，然后用高倍油浸镜下详细观察染色体的数目、形态等。拍照，洗相。
9、核型分析：按同源染色体的相对长度、着丝点位置等特征依次排常染色体，最后排列出性染色体。
五、作业
1、简写骨髓细胞直接染色体制片的步骤与方法。 2、画出所观察染色体的图象。
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骨 淋 培 肿 秋 摘 低 固 铺 染 镜 核 巴 养 瘤 组 组 髓 结 织 织 水 仙 素 处 理 出 组 织 渗 处 理 定 细 胞 片 色 检 照 相 型 分 析 实验三 染色体相对长度和臂比的测定
一、目的：掌握染色体组型分析的方法。
染色体相对长度和臂比的测定是研究染色体形态、结构和计算的必要方法，是研究染色体组型（核型）的最基本方法。
二、器具：显微镜、测微尺、量角规（分规）、毫米尺、计数器、绘图铅笔。 三、材料：放大配对的染色体组型。 四、公式：
某染色体的相对长度（%）=X–某对染色体的绝对长度 A–全相染色体的总长度
染色体的相对长度是用每条染色体的长度分别占全组染色体总长度的百分比来表示。
臂比=
五、方法与步骤
1、选择：选取一个中期染色体分散良好的细胞，进行显微镜摄影，将底片放大成照片。 2、测量：在显微镜下，把放大照片上的每条染色体用测微尺依次测量其长度，以微米为单位记下绝对长度。记录每条染色体的绝对长度，长臂和短臂的长度以及染色体的类型。在显微镜下用测微尺量染色体的实际长度时，每个细胞中只选取一条染色体加以测量，依次与放大照片换算，即可求得每条染色体的实际长度。
X A长臂长度
短臂长度4