Western-Blot操作流程

试剂配制

蛋白提取试剂 1. RIPA裂解液：

50mM Tris（MW121.14，PH7.5） 3.02g 150mM NaCl 4.38g 1%TritonX-100 5ml 1%脱氧胆酸钠 5g 0.1%SDS 0.5g 蒸馏水至 500ml。 调pH值至7.5。

混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。 2. 蛋白酶抑制剂cooktail

所需母液成分： （1）100mmol/L PMSF

PMSF 17.4mg 异丙醇 1ml

溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。 （2）10mM 亮肽素leupeptin: -20℃保存 （3）2.1mg/ml 抑肽素Aprotinin: 4℃保存

配制： 成分 终浓度 每ml裂解液所加母液量

PMSF 1mmol/L（储存浓度稀释100倍） 10ul Leupeptin 0.1mmol/L（储存浓度稀释100倍） 10ul Aprotinin 1ug/ml （储存浓度稀释2000倍） 0.5ul

各成分直接加入所用的RIPA裂解液中 ，之后按照60ul/孔（12孔板）提取蛋白。

蛋白定量试剂 1. G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）

考马斯亮蓝G250 100mg 95％乙醇 50ml 85％磷酸 100ml 蒸馏水至 1000ml

配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存于棕色瓶中。

2．牛血清白蛋白BSA储存液（1mg/ml）：

100mg BSA粉末溶于20 ml双蒸水，定容至100 ml，加少量防腐剂，4℃保存。

上样用试剂 1．4X上样缓冲液

1.0 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2ml SDS 0.8g 溴酚蓝 0.04g 甘油 4ml

去离子水定容至10ml。混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。使用时稀释成1X。 2．1.0 mol/L二硫苏糖醇（DTT）（10X）

用20 ml 0.01 mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT,分装成1ml小份储存于-20?C。使用时稀释成1X。

例如：上样量20μl--4X上样缓冲液 5μl+ DTT 2μl + 样本蛋白13μl

工作液 制胶用（1-6）：

1. 1.0mol/L Tris·HCl （pH6.8） Tris (MW121.14) 12.114g 蒸馏水 100ml

溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。 2. 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 18.671g 蒸馏水 100ml

溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。 3. 10％SDS

SDS 10g 蒸馏水至 100ml

如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。 如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 4. 10％过硫酸胺（AP）

过硫酸胺 0.1g 蒸馏水 1ml

（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周） 5． 四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4?C保存。 6． 30%丙稀酰胺： 4?C保存。 10%下层胶（两块胶，15ml）：

依次加入 去离子水 5.9ml