外源蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达和胞外分泌策略研究综述 下载本文

外源蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达和胞外分泌策略研

究综述

摘 要:采用大肠杆菌作为表达宿主进行蛋白质异源表达的研究逐渐增多,然而实验过程中存在2个突出问题:(1)可溶性表达量低;(2)胞外分泌能效差。该文系统地综述了当前的国内外研究现状,内容涉及外源蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达策略及胞外分泌策略,并对实验中存在的问题和和研究趋势提出了见解。部分策略已用于实验教学并取得了良好的教学效果。

关键词:大肠杆菌;可溶性表达;胞外分泌;研究趋势 中图分类号 R394.8 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2015)13-25-03

Advances of Soluble and Extracellular Overexpression of Heterologous Proteins in Escherichia coli Chen Ana et al.

(School of Biochemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

Abstract:Heterologous proteins expression in E.coli has been gradually increased in recent years. However,there are two outstanding issues during the experiment(1)low soluble

expression level;(2)poor secretion efficiency. This paper systematically reviews the currentresearch status,which relates strategies of soluble expression,extracellular secretion,experimental problems in E.coli,and puts forward opinions of research trends. Some of the strategies have been used in experimental teaching and achieved good teaching results. Key words:E.coli;Soluble expression;Extracellular secretion;Research trends

采用野生型菌种发酵生产目标蛋白的效率较低,通过基因工程技术进行异源高效表达是降低生产成本的有效途径。常用的宿主菌为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌,也有在毕赤酵母中表达的报道。与其他宿主菌相比,大肠杆菌具有3个显著优势:细胞生长快速、分子操作简单和能在廉价培养基中高密度培养,使其成为科研、生产中最常用的原核表达宿主[1]。但是我们并不回避外源基因在大肠杆菌中表达时存在的2个突出问题:(1)可溶性表达量低;(2)胞外分泌能效差[2]。近年来研究者尝试了多种策略提高可溶性表达量和分泌效率,研究主要集中在调控发酵过程参数,优化培养基等措施上,对外源蛋白自身改造的研究相对较少。 1 研究现状

外源蛋白在大肠杆菌中的表达调节是一个包括诸多元素的复杂系统,并非每一种蛋白都能在大肠杆菌中高效表

达,部分蛋白无法表达[3]。由于大肠杆菌分泌系统的组成元件复杂、调控精细以及固有的双层膜结构,因此大肠杆菌表达系统的分泌性能较差[4]。笔者对当前外源蛋白在大肠杆菌中过量可溶性表达策略和高效分泌策略概括如下。内容涉及质粒改造、宿主菌改造、底物蛋白改造、发酵过程参数调控及培养基优化等方面。

1.1 质粒和宿主的有效改造和组合 通过对质粒元件的合理构建,可在转录水平和翻译水平上调节蛋白合成。如在指导学生采用大肠杆菌表达人源化治疗性抗体片段时,对pAVEwayTM质粒进行操纵子双回文结构改造和启动子替换,使得外源蛋白的表达量显著提升(数据还未发表);Olins等从T7噬菌体基因前导序列中鉴定了―9bp的序列g10-L,该序列能使多种基因的表达水平提高40~340倍。若将其置于合成SD序列的上游,按照β-半乳糖苷酶的活性与LacZ mRNA的水平来估计,g10-L序列能使LacZ的翻译水平提高110倍[5]。大肠杆菌II型分泌系统中蛋白跨外膜分泌主要依靠非特异性渗漏,效率较低,可通过构建外膜渗漏型突变株以提高蛋白胞外分泌水平。如Gumpert等构建了缺少细胞壁和周质空间的L-型菌株用于青霉素G酰基转移酶、葡萄球菌激酶和微小抗体的制备[6]。Ni等构建了敲除外膜脂蛋白的突变株,使麦芽糖结合蛋白、木聚糖酶和纤维素酶的胞外分泌比例达到总表达量的90%以上[7]。早期的研究多集中在此领