细胞增殖的基因发生突变，产生不正常的增殖信号或对增殖信号作出不正确的反应，都可能引发细胞癌变。

⒓何谓操纵子？根据操纵子模型说明酶的诱导和阻遏。

答：操纵子是指原核生物基因表达的协调单位，包括结构基因、调节基因及由调节基因产物所识别的控制序列（启动子、操纵基因）。 根据操纵子对调节基因表达的小分子所作出反应的特点，分为可诱导（inducible）和可阻遏（repressible）两类。

例如在细菌的培养基中只有在加入代谢的诱导物之后，细菌才产生一种酶。这就是可诱导的操纵子；如在培养基中加入足量的某些合成物的成分，就可以阻遏合成时所需的一系列酶的

产生，这就是可阻遏操纵子。

⒔为什么说在酶诱导中的调节蛋白起负调节作用，而在降解物阻遏中的调节蛋白起正调节作用？

答：酶的诱导和阻遏是在调节基因产物阻遏蛋白（调节蛋白）的作用下，通过操纵基因控制结构基因或基因组的转录而发生的。由于经济的原则，细菌通常并不合成那些在代谢上无用的酶，因此一些分解代谢的酶类只在有关的底物或底物类似物存在时才被诱导合成；而一些合成代谢的酶类在产物或产物类似物足够量存在时，其合成被阻遏。在酶诱导时，阻遏蛋白与诱导物相结合，因而失去封闭操纵基因的能力。

对代谢降解物敏感的操纵子受到降解物的阻遏，有关的调节蛋白起正调节作用。当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长时，通常优先利用葡萄糖，只有葡萄糖耗尽后，细菌经过一段停滞期，在乳糖诱导下才能利用乳糖，这种现象称为葡萄糖效应或降解物阻遏。

⒕何谓衰减子？说明它的作用机制和生物学意义。

答：在色氨酸操纵子中存在一种转录水平上调节基因表达的衰减作用（ attenuation ），用以终止和减弱转录。这种调节作用称为衰减子（ attenuator ），是一种位于结构基因上游前导区的终止子。

衰减子的作用机制是前导区编码 mRNA 的前导序列，该序列可合成一段小肽（前导肽），它在翻译水平上控制前导区转录的终止。

衰减子控制转录起始后是否继续下去，是比之阻遏作用是更为精细的调节。

⒖将细菌从贫瘠培养基中转移到丰富培养基中其代谢会发生什么变化？ 答：将细菌从贫瘠培养基中转移到丰富培养基中，其代谢会加强，生长速度加快。 ⒗何谓反义RNA？它的发现有何理论意义和实践意义？

答：反义RNA是指可与mRNA或有义DNA链互补导致正常翻译终止的RNA分子。

由于通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA ，可特异性地抑制靶基因；通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,可诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。因此，反义RNA的发现，为人为精细调控基因的表达提供了一条新的途径。

⒘说明真核生物基因表达调节机制的主要特点。 答：真核生物基因表达调节机制的主要特点是：真核生物细胞基因的表达可随细胞内外环境条件的改变和时间程序面在不同表达水平上加以精确调节。基因表达是有多个层面上进行的多级调控： （1） 转录前水平的调节 ：染色体丢失；基因扩增；基因重排；染色体 DNA 的修饰和异染色质化。

（2）转录活性的调节：染色质的活化；启动子和增强子的顺式作用元件；调节转录的反式作用因子。

（3） 转录后水平的调节：戴帽；加尾；甲基化修饰；拼接。 （4）翻译水平的调节：对可溶性蛋白质因子的修饰；对 mRNA 稳定性的调节；. 反义 RNA 对翻译水平的调控。

（5） 翻译后水平的调节：切割；化学修饰；连接。

⒙真核生物转录前水平的基因调节主要有哪些方式？

答：真核生物转录前水平的基因调节主要有染色体丢失、基因扩增、基因重排、染色体 DNA 的修饰和异染色质化等方式。

⒚比较真核生物和原核生物转录水平与翻译水平的调节的异同点。 答：原核生物的基因组和染色体结构都比真核生物简单，转录和翻译在同一时间和空间内发生，基因表达的调控主要发生在转录水平。原核生物通过由结构基因、调节基因及由调节基因产物所识别的控制序列（启动子、操纵基因）等所组成的操纵子对基因的表达进行调节。真核生物有细胞核结构，转录和翻译过程在时间和空间上都被分隔开，且在转录和翻译后都有复杂的信息加工过程，其基因表达的调控可以发生在各种不同的水平上。

真核生物不组成操纵子，不形成多顺反子mRNA。真核生物在转录水平上的调节包括染色质的活化和基因的活化，基因转录受顺式作用元件，包括启动子、增强子及其应答元件的控制；也受反式作用因子如基本转录因子、上游转录因子和转录调节因子等的调节。真核生物翻译水平的调节主要是控制mRNA的稳定性和有选择的进行翻译。

⒛结合DNA的反式激活因子结构有何特点？

答：结合DNA的反式激活因子，除特异结合DNA的结构域外，通常都另外还有一个或多个结构域，用于转录的活化或与其它调节蛋白相互作用。常见的活化结构域有酸性活化结构域、富含谷胺酰胺结构域以及富含脯胺酸结构域。

21.真核生物转录后和翻译后均存在复杂的信息加工，试分析其生物学意义。 答：真核生物转录和翻译的位置被核膜隔开，转录和翻译后的信息加工较为复杂。其生物学意义有：

RNA转录后的一系列加工可使RNA转录后的初产物变成成熟的、有功能的RNA，有些加工还可改变RNA携带的遗传信息，有利于生物的进化，是对“中心法则”的校正和补充。 蛋白质的翻译后修饰和加工，是指在肽链合成完成后进行的化学反应，如磷酸化、羟基化、糖基化、二硫键形成，以及最近发现的蛋白质自剪接等等，可能有一百种以上。翻译后修饰和加工使得蛋白质的组成更加多

样化，蛋白质结构呈现更大的复杂化，从面增加生物适应环境变化的能力。对蛋白质的正常生理功能是必需的，它们的变化往往和疾病的发生有关。 第40章 基因工程及蛋白质工程

⒈DNA分子克隆包括哪些步骤？有何应用价值？ 答：DNA分子克隆是指将DNA的限制性酶切片段插入克隆载体，导入宿主细胞，经无性繁殖，以获得相同的DNA扩增分子。DNA分子克隆包括切割DNA分子、将外源DNA导入载体、将外源DNA导入宿主细胞以及宿主细胞的无性繁殖等步骤。

克隆得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。

⒉大肠杆菌pBR322质粒含有10个HinfⅠ的酶切位点，当以此酶部分水解时可得到多少种限制片段？ 答：91种。

⒊克隆载体的必要条件是哪些？

答：克隆载体应具备的必要条件:

① 具有复制子，在宿主细胞 并携带重组DNA分子一同扩增；

② 有单一限制性(multiple cloning site，MCS)，MCS是人工合成的一段含有多个不同的单一限制性 营养缺陷体及噬菌斑形成能力等，便于筛选出阳性重组体； ④ 拷贝数高(10—200个／每个细胞)，易于分离； ⑤ 生物安全性好。

⒋比较柯斯质粒和γ噬菌体为载体进行DNA克隆的异同。

答：柯斯质粒具有λ噬菌体的特性，即在克隆了外源片段后可在体外被包装成噬菌体颗粒，高效地感染对λ噬菌体敏感的大肠杆菌细胞。进入寄主的柯斯质粒DNA分子，按照λ噬菌体DNA的方式环化， 但无法按噬菌体的方式生活，更无法形成子代噬菌体颗粒。 柯斯质粒在寄主细胞内如质粒一样进行复制，携带有抗性基因和克隆位点，并具氯霉素扩增效应。

柯斯质粒具有高容量的克隆能力，柯斯质粒本身一般只有5～7kb左右，而它克隆外源DNA片段的极限值竟高达45kb，远远超过质粒载体及λ噬菌体载体的克隆能力（9-23kb）。同时，由于包装限制，柯斯质粒载体的克隆能力还存在一个最低极限值。例如， 5 kb大小的柯斯质粒载体，插入的外源片段至少不能小于30 kb。

⒌如何进行单链DNA的克隆？ 答：可用M13载体进行单链DNA的克隆。具体步骤包括单链DNA模板的制备，载体DNA的制备，体外连接与包装，重组噬菌体感染大肠杆菌，单链DNA克隆的鉴定与扩增等。

⒍有哪些方法可以使外源DNA与载体DNA相连接？比较它们的优点。

答：外源DNA片段与载体DNA分子的连接，即DNA分子的体外重组，主要依赖于限制性内切核酸酶及DNA连接酶的作用。

外源DNA片段与载体DNA分子的连接有多种。一种是用用两种不同的限制酶同时酶解一种特定的DNA分子，产生具有两种不同末端（粘性末端与另种粘性末端、粘性末端与平齐末端）的DNA片段，那么可实现外源DNA片段定向插入载体分子。另一种是非互补粘性末端DNA分子的连接，即在一定的反应条件下，可用T4 DNA连接酶将平齐末端的DNA片段有效地连接起来；对于非互补粘性末端DNA分子，在用特异作用干单链DNA的S1核酸酶处理，使其变成平齐末端后，也可用 T4 DNA连接酶进行有效的连接。其三，可采用附加衔接物（linker，是一种人工合成的双链DNA短片段，其上具有一个或数个在将与其连接的载体DNA上不存在的限制酶识别位点，可按平齐末端连接法给平齐末端片段加上相同识别位点的衔接物，再用在衔接物中具有识别位点的合适限制酶切割，用常规方法连接）的方法，提高平齐末端间的连接作用效率。其四，可利用接头进行DNA平齐末端门的连接。接头（adaptor）是一种具有粘性末端的短核昔酸双链，它与平齐末端连接后，不用经过切割即可与载体相连。 这些方法是在不同的情况下发挥作用的，谈其所谓的“优点”有些牵强。应根据具体研究对象的特点和研究目的，灵活选用。

⒎将重组DNA导入细胞内有哪些方法？它们的原理是什么？

答：根据重组DNA时所采用的载体性质不同，导入重组DNA分子有转化、转染、感染

和注射等不同手段。

：①转化，用质粒作载体所常用的方法。②转染，用噬菌体DNA作载体所用的方法，这里所用的噬菌体DNA并没有包上它的外壳。③转导，用噬菌体作载体所用的方法，这里所用的噬菌体DNA被包上了它的外壳，不过这外壳并不是在噬菌体感染过程中包上，而是在离体情况下包上的，所以称为离体包装。④注射，如果宿主是比较大的动植物细胞则可以用注射方法把重组DNA分子导入。

⒏基因文库和cDNA文库有何不同？为什么要建立cDNA文库？ 答：基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。cDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。 真核生物的基因是断裂的，需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起；真核生物的基因不能直接在原核生物中表达，只有加工成熟的mRNA经逆转录合成的cDNA接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达；另外，真核生物细胞中只有一小部分mRNA进行表达，mRNA的稳定性差。因此，需要构建cDNA文库，用于基因表达等方面的研究。

⒐建立人胚cDNA文库，以致人胚低丰度mRNA为28 000种，占总mRNA的40%，为使低丰度cDNA存在的概率大于99%，此文库应包含多少克隆？ 答：3.2×105。

⒑原位杂交的原理是什么？有何用途？

答：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。

利用原位杂交，可在光镜或电镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定位；可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。

⒒何谓差别杂交和扣除杂交？举例说明用以分离基因的过程。

答：差别杂交（differential hybridization）又叫差别筛选（differentual screening），适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA之cDNA克隆。为了增加这种方法的有效性，后来又发展出了扣除杂交技术。扣除杂交（subtractive hybridization）又叫扣除cDNA克隆（subtractive cDNA cloning），它是通过构建扣除文库（subtractive library）得以实现的。

差别杂交的技术基础需要有两种不同的细胞群体：在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达。在这种情况下便可制备到两种不同mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA种的总mRNA群体，其二是不含有目的基因mRNA种的总mRNA群体。通过这两种总mRNA（或是它们的cRNA拷贝）为探针的平行杂交，对由表达目的的基因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。当使用存在目的基因的mRNA探针时，所有包含着重组体的菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点；而使用不存在目的基因的mRNA探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板，便可以挑选出含目的基因的菌落，供作进一步研究使用。

扣除杂交是用一般细胞的mRNA与特殊细胞的cDNA杂交，先扣除一般共有的cDNA，再交剩下特异的cDNA进行克隆。

下面以T 细胞受体（T-cell receptor，TCR；有时亦称之为T细胞抗原受体）编码工因的分离为例子，说明扣除杂交筛选法的基本原理与简要过程。

TCR基因只能在T细胞中表达，而不能在B细胞中表达。从T细胞mRNA制备来的单链cDNA，

同大大超量的B细胞的mRNA在有利于发生DNA-RNA杂交的条件下保温，所有的能够在T和B两类细胞中同时表达的T细胞基因的cDNA分子（约占98%），都能与B细胞的mRNA退火形成DNA-RNA杂交分子，而不能在B细胞中表达的、T细胞特有的cDNA（约占2%），由于B细胞中没有相应的mRNA，仍然处于单链的状态。将此种杂交混合物通过羟基磷灰石柱（hydroxylapatite column），于是DNA-RNA杂交杂分便结合在柱上，而游离的单链cDNA则过柱流出。如此回收入到的T细胞特异的cDNA被转变为双链cDNA之后，与适当的λ噬菌体载体重组并转染给大肠杆菌寄主细胞，这样便得到了T细胞持cDNA高度富集的扣除文库。然后再按照同样方法制备扣除的cDNA探针，即被B细胞mRNA杂交扣除了的T细胞特异的cDNA探针，筛选文库，结果成功地分离到了T细胞的TCR基因。

⒓说明聚合酶链式反应(PCR)的原理和用途。

答：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶