（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。

PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：

(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针； (2) 由少量mRNA生成 cDNA文库； (3) 从cDNA中克隆某些基因；

(4) 生成大量DNA以进行序列测定； (5) 突变的分析； (6) 染色体步移；

(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。

⒔基因定位诱变的主要方法有哪几种？它们的原理是什么？

答：基因定位诱变的主要方法有酶切诱变、寡核苷酸指导的诱变和PCR诱变。 酶切诱变：利用基因的酶切位点，在切点处改造基因序列。 寡核苷酸指导的诱变：利用克隆技术将人工合成的寡核苷酸片段插入到目的基因的序列中。 PCR诱变：通过PCR引物在扩增片段的两端引入各种变异，嵌套式PCR还可以在基因内部或在一次PCR中同时在多处引入变异。

⒕比较两种DNA快速测序的方法，包括方法的原理和优缺点。

答：目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的双脱氧法（酶法）及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特

定的一种或者多种残基上。由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因些上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定。然后在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道这上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。 Sanger法DNA测序

Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸

上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

Sanger 法测序快速、省事，不需要比强很高的32P-dNTP,但有时会出现一些不够清晰的结果。 Maxam－Gilbert DNA化学降解法

化学降解法的原理是首先标记双链DNA的5’端，然后加入二甲基亚砜并加热到90°C，使双链DNA分子变成单链。通过凝胶电泳分离两条链，其中一条链含有更多的嘌呤成为重链，另一条链为轻链。纯化两条链，分成四份，分别利用不同的降解试剂进行降解（哌啶,氮杂环己烷），产生了一系列的降解片段。可以通过电泳分离显示出来。

化学降解法可以提供比较清晰的结果，但步骤繁琐，许多药品有剧毒。

⒖基因表达的主要控制元件有哪些？真核生物和原核生物有何差别？

答：基因表达的主要控制元件有启动子、核糖体结合位点、转录终止信号等。 启动子：原核启动子约55bp,分为起始点（start site）、结合部位、识别部位。起始点：转录起始部位以+1表示，转录的第1个核苷酸常为嘌呤---G,A。结合部位：约6bp组成,是高度保守区,共有序列为5’-TATAAT-3’ ,位于起始点上游-10。因Tm低,DNA易解开双链，为RNA聚合酶提供场所。识别部位：约6bp组成,在-35处,为高度保守区,序列5’-TTGACA-3’, s因子识别此部位。

真核启动子于-25处含AT富集区, 共有序列为TATAA（TATA box），-70处含共有序列CAAT ,还含许多其它box ,例如 GC box,E-box等。含增强子(enhancer)和静息子(silencer) RNA polⅠ和 RNA polⅢ与聚合酶Ⅱ所识别的启动子差异较大。

核糖体结合位点：在大肠杆菌等原核生物mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA 3，末端碱基互补的序列，即SD序列，而真核基因则缺乏此序列。

转录终止信号：在一个基因的3’端或是一个操纵子的3，端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子(terminator)。原核生物终止信号在结构上有一些共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G／C的区域，G／C富含区域又具有回文对称结构，这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构。根据转录终止作用类型，终止子可分为两种，一种只取决于DNA的碱基顺序；另一种需要终止蛋白质(p因子)的参与。

真核生物转录终止序列，在3’端之后有共同序列AATAAA及多个GT序列，mRNA在转录终止序列处被切断。

⒗分析融合蛋白表达和非融合蛋白表达的利弊。 答：融合蛋白表达和非融合蛋白表达的利弊：外源基因的活性蛋白质第一个氨基酸可能不是蛋氨酸，在表达时需要加上蛋氨酸的密码子，有时外加的蛋氨酸会影响产物活性；蛋白质的N端序列对其合成和折叠有较大影响，将外源基因编码序列与宿主细胞高表达基因N端序列融合，以融合蛋白形式表达可以提高表达水平；外源蛋白在宿主体2 μ 质粒：从酵母菌天然的质粒上截取一段包含复制序列的 2μ DNA。

其优点是非常稳定，可确保细胞分裂时，质粒的性状可移交到子代中不遗失。 (2) ARS 质粒：从酵母菌的染色体中截取一段ARS 片段。ARS是表示

Autonomously replicating sequence。ARS 质粒的稳定性较差，质体常被分解而无法代代相传。但是若加入一段着丝粒序列（centromere sequence ），变成CEN 质粒，就可使质粒稳定性提高，但CEN 质粒的拷贝数较低，一般为单拷贝。 (3)酵母人工染色体(YAC ，yeast artificial chromosome)，这种载体除了上述ARS, CEN序列外，两端再加上端粒序列，形成彷彿就是染色体般的外观，故名之。 其特性是容量 (capacity) 超大，可承载 0.2 - 2.0 Mb DNA的长度。多被用于构建基因组文库用。

⒙如何将外源基因导入植物细胞并使之表达？

答：外源基因导入植物细胞并使之表达的方法，分为载体法和直接法两类。载体法是目前最常用的一种方法，最初的载体是土壤农杆菌中的原质粒，在原质粒上有一段DNA，即T-DNA，在土壤农杆菌浸染植物细胞时，T-DNA能够插入植物细胞的基因组中，且能稳定地遗传给其后分离出来的细胞，载体法的优点是操作简便，遗传表达比较稳定，但这些载体仅适用于双子叶植物基因。直接法是将目的基因直接导人受体的细胞中，它包括以原生质为受体的化学转化法，如PEG(聚二乙醇)它以聚二乙醇为融合剂将异源原生质融合在一起，即原生质融合法。磷酸钙-PEG，改良的原生质融合法。电击穿孔法，就是通过很高的电压，迅速将细胞膜的一部分打开，使外源DNA进入原生质体中。显微注射法，就是直接用注射针位射到细胞里。

⒚什么是基因治疗？常用的载体有哪几种？

答：所谓基因治疗（gene therapy）是指向受体细胞中引入具有正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，也可以是利用引入基因以杀死体内的病原体或恶性细胞。

基因治疗中的载体有病毒载体和非病毒载体。其中常用的病毒载体有：反转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒伴随病毒载体和疱疹病毒载体等；常用的非病毒载体有：裸DNA、脂质体/DNA复合物、多聚物/DNA复合物等。

⒛什么是蛋白质工程？举例说明蛋白质工程的意义。

答：蛋白质工程，就是利用基因工程手段，包括基因的定点突变和基因表达对蛋白质进行改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。 蛋白质工程也具有广泛的应用前景 比如在医学上，用人工手段去改造某些致癌基因的产物——蛋白质，使它失去致癌作用，从而开辟治疗癌症的新途径。我国的蛋白质工程具有国际先进水平，这些工程包括重组人胰岛素和溶血栓药物，重组人尿激酶等。

在食品工业、日用品工业方面，用经过改造的稳定性好的酶，可由价格便宜的棕榈油生产出价格昂贵的可可脂，从而创造很高的经济效益。荷兰一家公司设计了一种能和漂白剂一同起作用的去污酶，并且通过对这种酶上的两个氨基酸的修改，使这种酶具有较高抵抗力，在洗涤过程中不受破坏。因此，通过蛋白质工程可实现常规酶工程手段不能实现的目标。

对动植物体内参与重要生命活动的酶加以修饰和改造，是蛋白质工程未来发展的一个重要目标。有朝一日，人们一定能够通过蛋白质工程来设计、控制那些与DNA相互作用的调控蛋白质，到那时，人为控制遗传、改造生命就不再是天方

夜谭了。

21.叙述DNA改组的步骤和原理。

答：DNA改组是指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(sexual recombination)。通过改变单个基因(或基因家族， gene family)原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。 DNA改组的步骤和原理：

（1）错误倾向PCR：通过改变传统PCR反应体系中某些组分的浓度,或使用低保真度的DNA聚合酶等,使碱基在一定程度上随机错误引入而创造序列多样性文库。

（2）自身引物PCR：DNA片段重叠部分两互补链的3‘端彼此配对，各作为引物，以互补链为模板向前延伸，然后以同样的方式与互补链配对延伸，直至合成全长的基因。

（3）重组合PCR：用基因5、和3、端引物将上述经重组合的全长基因扩增出来，即可用于表达和选择。

22.提出你对基因工程未来发展的看法。

答：基因工程开辟了生物学研究的新纪元，带动了生物技术产业的兴起。概括地讲，基因工程未来发展是前途光明，道路曲折。