生物大量繁殖，以提高其在群体中的比例，以便于分离。Eg：通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制无关的微生物至少是数量上减少尽量无关的微生物

如：碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，选择利用这唯一碳源才能大量正常生长的微生物，而淘汰其它微生物。 3 ）纯种分离：将增殖培养效果显著的优势菌种（混杂生长的微生物）。进—步控制富集培养的选择性条件，采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落

纯种分离法：（1）菌落纯：a 平板表面涂布法 b 平板划线分离法 c 琼脂培养基浇注法。（2）细胞纯：a 用分离小室进行单细胞分离 b 用显微操纵器 c 用菌丝尖端切割 4 ）性能测定

11、如何从土壤中分离得到一个微生物的纯培养体?

首先要根据分离对象选择适宜的培养基。若要分离真菌应选用马丁-孟加拉红选择培养基；若要分离细菌应选用牛肉膏蛋白胨培养基；若要分离放线菌应选用高氏培养基。

土样采回来后，用常规的十倍稀释分离法进行稀释分离，若分离细菌，一般稀至10-8,若分离放线菌,一般稀至10-6；若分离真菌，一般稀至10-4。取最后三个稀释度倒平板获得单个菌落。

将平板上出现的单菌落转接斜面培养，同时镜检菌体的纯度，若不纯，应将培养的单菌落斜面再次进行稀释分离。倒平板获得单菌落，转接斜面培养，同时镜检菌体的纯度。反复几次直到得到菌体单一的单菌落方可认为是某一微生物的纯培养体。

制作菌种稀释液：称取10g甜酒曲压成粉状，放入已灭菌的盛有90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中溶解。接着用1mL的无菌移液管吸取1mL甜酒曲稀释液加入盛有9mL无菌水的试管中充分摇匀，此为10-2稀释液，以此类推制成10-3，10-4，10-5，10-6几种稀释度的甜酒曲溶液[2]。

涂布：将上述凝固好的培养基平板底部用记号笔分别写好稀释度字样，然后用1mL的无菌移液管分别由10-4，10-5和10-6的试管中吸取稀释液0.1mL对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒，在各培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5-10min，使菌液吸附进培养基[3]。

划线：在近火焰处，蘸取10-2，10-3的稀释液一环在平板上划线。 培养：将上述平板倒置于28℃培养箱中培养1星期。

挑菌落：取出培养基观察单菌落的生长情况。由根霉菌落的特点挑取少许单个菌落的菌丝接到斜面培养基上，放置培养箱中培养1星期。检查其特征是否一致，若不一致，即发现杂菌，则需在斜面上继续挑取菌丝培养，继续纯化，直至获得纯培养。

7某药厂生产林可霉素，该厂为了提高产量，请你从微生物遗传变异的角度来为该厂设计获得高产菌株的方案。

①诱变得三个环节：

a突变的诱发，b突变株的筛选，c突变高产基因的表型 ②基本步骤

出发菌株的选择 处理菌悬液的制备 诱变处理 中间培养 分离和筛选

诱变育种基本原则：1选择简便有效的诱变剂 2挑选优良的出发菌株3处理单细胞或单孢子悬液4选用最适的诱变剂量5充分利用复合处理的协同效应6利用和创造形态生理与产量间的相关指标7设计高效筛选方案8创造新型筛选方案

① 出发菌株的选择

选择野生型菌株，对诱变处理较敏感，效果好

出发菌株选2～3株，在处理比较后，取更适合的出发菌株作继续诱变。 ② 菌悬液的制备

制备单细胞和单孢子、活力类似的菌悬液。 ③ 诱变处理

根据诱变剂特性，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。 ④ 中间培养（稳定性试验）

突变表型有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。 方法：

处理后细胞在液体培养基中培养几小时，让细胞繁殖5代，以得到纯的变异细胞。 ⑤ 分离和筛选

初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。以变色圈或透明圈的大小将90%的菌落淘汰

复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。以效价和稳定性选得优秀菌株 ②操作步骤

1. 菌液以3000r／min离心5min，弃上清，沉淀用无菌生理盐水再离心洗涤 2. 将菌液用无菌玻璃珠的三角瓶内摇匀，细胞数可达108个／ml左右，作为待处理菌悬液。

3.分别取梯度105 ,106,107,108个细胞数／ml 菌液4m1于9cm培养皿内，预热紫外灯10min，开启皿盖,无菌磁力搅拌照射10～50s。操作均避免白炽光,在红灯下进行，或用黑纸包住。

4. 取未照射的菌液和照射菌液各o.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。 5. 取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120r／min

振荡培养4～6h。

6．取中间培养液稀释分离、培养。 7．挑取菌落进行筛选。

8. 计算致死率,正突变率,负突变率 出发菌株 林可霉素产生菌 菌种复壮；狭义；指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状，生产性能等指标从以衰退的群体中筛选出少量未退化的个体。

措施；纯种分离法；1纯种分离法2通过宿主体复壮3淘汰以衰退的个体 第十章

1试述在菌种鉴定中常用的甲基红(MR)和V.P.试验的原理

（1）甲基红试验原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降至4.5以下，当加入甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度仍在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。 （2）培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基医学教|育网搜集整理。

（3）方法：将待检菌接种于上述培养基中，培养2～4d，于培养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。

（4）结果：呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。

（5）应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。此外肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。

V.P

2 原理

某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。 2简述微生物菌株鉴定的主要步骤和微生物的分裂鉴定方法。

a获得该种微生物的纯种培养 b 测定一系列必要的鉴定指标 c 查找权威性的鉴定手册

方法：a 经典方法：1 经典的鉴定指标 2 微生物的微型，简便，快速或自动化鉴定技术

b 现代方法：1通过核酸分析鉴定微生物遗传型 2 细胞化学成分用作鉴定指标 3 数值分类法

第十章

分类学的3个具体任务：分类，鉴定，命名。

微生物的种是一个基本分类单元，它是一大群表型特征高度相似，亲缘关系极其接近，与同属内其他物种有着明显差异的一大群菌株的总称。在微生物中，一个种只能用该种内的一个典型菌株当做他的具体代表，故此典型菌株就成了该种的

模式种。

双名法是由前面一个属名和后面一个种名加词构成。 菌株：它表示任何一个由独立分离的单细胞繁殖而成的纯遗传性群体及其一切后代。在同一菌种的不同菌株间，作为鉴定用的一些主要形状上虽个个相同，但不作为鉴定用的一些小性状却可以有很大差异，尤其是一些生化形状，代谢产物的产量性状等。

三域学说：三域指古细菌域，真核生物域，真细菌域。 伯杰氏手册，原核生物

Ainsworth等人的菌物分类系统纲要，真菌

微生物分类鉴定方法的4个不同水平：a细胞形态和习性水平b细胞组分水平c蛋白质水平d核酸水平：包括G+Cmol%值测定，核算分子杂交，rRNA寡核苷酸编目分析。

菌种鉴定基本步骤：a获得该微生物的纯培养物b测定一系列必要的鉴定指标c查找权威性的菌种鉴定手册。 数值分类法：是一种依据数值分析的原理，借助现代计算机技术对拟分类的微生物对象按大量表型形状的相似性程度进行统计，归类的方法。 B.s 枯草芽孢杆菌 E.c 大肠杆菌

S.a 金黄色葡萄球菌 S.c酿酒酵母椭圆变种 A.放线菌属

S.g 灰色链霉菌 C.u 产朊假丝酵母 A.f 黄曲霉 A.n 黑曲霉 R o 米根霉

名词解释

1伴孢晶体：少数芽包杆菌在形成芽孢的同时，会在芽孢旁侧形成一颗方形，菱形或不规则形的碱溶性蛋白质晶体。

2L型细菌：指在实验室或宿主细胞内，通过自发突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺损菌株。

3古生菌：又称古细菌。是一个在进化途径上很早就与真核生物与真细菌相互独立的生物类群，主要包括一些独特生态类型的原核生物。

4菌物界：指和植物界动物界相并列的一类无叶绿素，依靠细胞表面吸收有机养料，细胞壁含几丁质的真核微生物。

7包涵体；动植物细胞中的病毒群体，颗粒状。

8温和噬菌体；噬菌体侵染宿主后，并不增殖裂解，而是与宿主DNA结合，随宿主DNA复制而复制，此时细胞中找不到形态上可见的噬菌体。 9溶源菌；含有温和噬菌体的细菌。

10类病毒，是一类 只含RNA一种成分，专性寄生在活细胞内的分子病原体。 11生长因子；是一类微生物正常生长代谢所必须，又无法从简单的碳源氮源自行合成的所需极微量的有机物。

12基团移位；是一种既需要特异性载体蛋白，又需要耗能的运输方式。

13选择性培养基；选择培养基是一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学，物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌群中劣势菌变优势菌的功能，广泛用于菌种的筛选等领域

14鉴别性培养基；培养基中加入能与某一菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而用肉眼就能使该菌菌落与外形相似它种菌落相区分的培养基

15次生代谢产物；指某些微生物生长到稳定期前后，以结构简单，代谢途径明确，产量较大的初生代谢产物作前体，经过复杂的次生代谢途径所合成的各种结构复杂的化学物

16ED途径；是少数EMP不完整的细菌所特有的利用葡萄糖的替代途径。 17发酵；目前泛指好氧型或厌氧型微生物用来生产代谢产物或食品饮料的一类生产方式，狭义；

18异型乳酸发酵；凡葡萄糖经乳酸发酵后除主要产生乳酸外还产生乙酸乙醇，CO2等其他产物的发酵称为异型乳酸发酵。

19生物固氮；是指大气中的分子氮通过微生物固氮酶的催化作用而还原成氨的过程。只有原核生物才有固氮能力。

20石碳酸系数；在一定时间内，被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石碳酸的稀释度之比。

21同步生长；通过获得同步培养物的手段，使细胞群体中各个体都处于分裂步调一致的生长状态

22连续培养；当微生物以单批培养的方式培养到指数期后期时，一方面以一定的速度流入新鲜的培养液和通入无菌空气，并立即搅拌均匀，另一方面以溢流的方式，以相同的速度不断流出培养物。于是容器内的培养物就可达到动态平衡，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和恒定的生长速率上，于是形成了连续生长，

23恒化器；根据培养其内微生物生长密度，借光电控制系统控制培养液流速，以达到菌体密度高，生长速率恒定的连续培养器。

24恒浊器；通过保持有一种生长限制因子的培养液的流速不变，使微生物始终处在低于其最高生长速率的条件下进行生长繁殖的连续培养器。

25质粒；凡游离于原核生物基因组外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状dsDNA分子‘

26F因子；又称F质粒，性因子，大肠杆菌等细菌决定性别并有转移能力的质粒 27营养缺陷型；指通过诱变育种而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸，维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。

28准性生殖；这是一种类似有性生殖但比有性生殖更原始的两性生殖方式，这是同种而不同菌株的体细胞间的融合，它可不借减数分裂而导致低频率的基因重组并产生重组子。

29溶源转变；当正常的温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体基因组整合到宿主基因组上，而使其获得除免疫性外的新遗传性状的现象。 30Ames实验；利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境或食品中是否存在化学致癌剂有效方法。

31互生；指两种可以单独生活的生物，当它们生活在一起时，通过各自的代谢的活动而有利于对方或偏利于一方的生活方式。