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当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较大的分子完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过，称“全排阻”。其流经体积最小，等于外水体积V0。 2、类分离：

将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离.选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。大分子的分配系数Kd=0，小分子的Kd=1。

3、分级分离：将分子量相差不大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，分级分离应尽量使待分离各物质的Kd值相差大些，并使分子量分布不在凝胶分离范围的一侧。 4、柱比：层析柱的长度与直径的比值一般称作“柱比”。

5、操作压：凝胶层析柱由于进出口之间液位压力差形成的对凝胶颗粒的压力称作“操作压”。

6、全渗入：被分离组分的分子量小于该种凝胶的渗入限，其分子可以自由进出凝胶颗粒，这叫做“全渗入”。 其流经体积最大，等于外水体积与内水体积之和，V0 ＋ Vi。 7、分离度Rs：Rs?2?Vel?Ve2?Vel?Ve2?Ve ??W1?W22??1??2?4?式中 Ve1、Ve2——对应于两个峰的淋出体积；W1、W2和σ1、σ2——两个峰宽度和标准偏差。 四、问答题

1、试述公式Ve=V0+KdVi 各字母的物理意义。

答：公式Ve=V0+KdVi中Ve代表被分离组分的流经体积，V0代表外水体积，Vi代表内水体积。

Kd称作“排阻系数” 或“分配系数”， 它反映了物质分子进入凝胶颗粒的程度。对一定种

类规格的凝胶，物质的Kd值为该物质的特征常数。排阻系数： Kd?Ve?V0 Vi当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。 0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。 2、利用凝胶层析如何测定蛋白质的分子量？

答：当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长，于是样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子（2分）。

对于一个特定体系（凝胶柱），待测定物质的洗脱体积与分子量的关系符合公式

Ve=-KlogM +C

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先以3个以上（最好更多些）的已知分子量的标准蛋白过柱，测取各自的Ve值。以Ve作纵坐标，logM作横坐标制作标准曲线（2分）。在同一测定系统中测取未知物质的Ve值便可由标准曲线求得分子量（2分）。

3、凝胶层析的应用主要有哪些？并说明其原理。

当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长，于是样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子（2分）。 应用：

一、脱盐：脱盐用的凝胶多为大粒度的，高交联度的凝胶。此时溶液中蛋白质等大分子的

Kd=0，盐类的Kd=1。由于交联度大，凝胶颗粒的强度较好，加之凝胶粒度大，柱层操作比较

便利，流速也高。

二、分子量测定：对于一个特定体系（凝胶柱），待测定物质的洗脱体积与分子量的关系符合公式

Ve=-KlogM+C

先以3个以上（最好更多些）的已知分子量的标准蛋白过柱，测取各自的Ve值。以Ve作纵坐标，logM作横坐标制作标准曲线。在同一测定系统中测取未知物质的Ve值便可由标准曲线求得分子量。

三、分离纯化：根据分子量不同流出先后顺序不同，收集单一洗脱峰的物质，得以纯化。

第八章 离子交换法（答案）

一、填空题

1、离子交换剂由 惰性的不溶性载体 、 功能基团 和 平衡离子 组成。 平衡离子带 正电荷 为阳离子交换树脂，平衡离子带 负电荷 称阴离子交换树脂。

2、常见的离子交换剂有离子交换树脂，离子交换纤维素，葡聚糖凝胶离子交换剂等。 3、离子交换树脂的基本要求有 有尽可能大的交换容量 、 有良好的交换选择性 、 化学性质稳定、 化学动力学性能好 和 物理性能好 。

4、影响离子交换选择性的因素主要有 离子价与离子水合半径 、 离子价与离子浓度 、交换环境 、 树脂结构 、 偶极离子排斥 等。

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5、请写出下列离子交换剂的名称和类型：CM-C的名称是羧甲基纤维素，属于弱酸型阳离子交换纤维素; DEAE-C的名称是二乙基氨基乙基纤维素，属于强碱型阴离子交换纤维素;。 6、色谱聚焦（chromatofocusing）是一种高分辨的新型的蛋白质纯化技术。它是根据蛋白质的等电点，结合离子交换技术的大容量色谱，能分离几百毫克蛋白质样品，洗脱峰被聚焦效应浓缩，分辨率很高，操作简单。

7、写出下列离子交换剂类型：732 强酸型阳离子交换树脂 ，724 弱酸型阳离子交换树脂 ，717 强碱型阴离子交换树脂 ，CM-C 阳离子交换纤维素 ,DEAE-C 阴离子交换纤维素 ，PBE94 阴离子交换剂 。

8、在采用多缓冲阴离子交换剂作固定相的离子交换聚焦色谱过程中，当柱中某位点之pH值下降到蛋白质组分 PI(等电点) 值以下时，它因带 正 电荷而 下移 ，如果柱中有两种蛋白组分，pI值较 大（高） 者会超过另一组分，移动至柱下部pH较 高 的位点进行 聚焦（交换） 。

9、影响离子交换选择性的因素有 离子水合半径 、 离子价与离子浓度 、交换环境 、 树脂结构 、 偶极离子排斥 。 二、选择题

1、用钠型阳离子交换树脂处理氨基酸时，吸附量很低，这是因为 （C）

A. 偶极排斥 B.离子竞争 C. 解离低 D. 其它

2、在酸性条件下用下列哪种树脂吸附氨基酸有较大的交换容量 （ C ）

A.羟型阴 B.氯型阴 C.氢型阳 D.钠型阳

3、在尼柯尔斯基方程式中，K值为离子交换常数， K＞1说明树脂对交换离子吸引力（ ）。

A. 小于平衡离子 B.大于平衡离子 C. 等于平衡离子 D. 其它 三、名词解释

1、蛇笼树脂：由丙烯酸或甲基丙烯酸在季胺型阴离子交换树脂（如Dowex）中聚合而成的一类树脂称蛇笼树脂。它是一种两性树脂，它适宜于从有机物质（如甘油）水溶液中吸附盐类，再生时用水洗，就可将吸着的离子洗下来。

1m1Z11Zm221?C2Z21Z?C111Zm111Zm221ZC1112、尼柯尔斯基方程式：?K, 即?K

C22Z其中m1、m2及C1、C2分别代表树脂上和溶液中的两种离子的浓度。K值的大小取决于树脂和交换离子的性质，以及交换条件。K＞1时说明离子A1比离子A2对树脂有较大的吸引力；反之，K＜1时树脂对A2的吸引力大于A1。

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3、偶极离子排斥作用：许多生化物质都是两性物质。其中有些是偶极离子。因为它们即使净电荷为零时，正电中心和负电中心并不重叠，遂成偶极。偶极离子在离子交换过程中的行为是很特殊的。现以氨基酸的离子交换为例。

??SO3Na??H3NRCCO? ??H3NRCOO??Na? SO3式中由于使用了钠型树脂，被吸附氨基酸的羧基所带的负电荷与树脂磺酸基之负电荷产生排斥力。这就是所谓偶极离子的排斥作用。因此使树脂对氨基酸的吸附量大大降低。

四、问答题

1、简述离子交换纤维素的特点有哪些？

答：离子交换纤维素的特点是：离子交换纤维素为开放的长链骨架，大分子物质能自由地在其中扩散和交换，亲水性强，表面积大，吸易附大分子；交换基团稀疏，对大分子的实际交换容量大；吸附力弱，交换和洗脱条件缓和，不易引起变性；分辨力强，能分离复杂的生物大分子混合物。

2、请以CM-C为例说明离子交换纤维素分离纯化蛋白质时的洗脱方法有哪些？并说出各种方法的洗脱原理。

答：无论是升高环境的pH还是降低pH或是增加离子强度都能将被吸附物质洗脱下来。现以羧甲基纤维素为例加以说明，图中H2N-P表示蛋白质，C表示纤维素。

OHCOCH2COO H3NP-+--+2NP H+2OCOCH2COO HH++3NPCOCH2COOH H-+++-COCH2COONa H+3NP Cl+NaCl

（1）、升高环境的pH，使蛋白质在此pH下失去电荷，从而丧失与CM-C结合力而被洗脱下来。

（2）、降低环境的pH，使CM-C在此pH下不解离，从而不能吸附蛋白质而被洗脱下来。 （3）、用高浓度的同性离子根据质量作用定律将目的物离子取代下来。

3、请以DEAE-C为例说明离子交换纤维素分离纯化蛋白质时的洗脱方法有哪些？并说出各种方法的洗脱原理。

答：无论是升高环境的pH还是降低pH或是增加离子强度都能将被吸附物质洗脱下来。

（1）、升高环境的pH，使DEAE-C在此pH下不解离，从而不能吸附蛋白质而被洗脱下来。

（2）、降低环境的pH，使蛋白质在此pH下失去电荷，从而丧失与DEAE-C结合力而被洗脱下来。

（3）、用高浓度的同性离子根据质量作用定律将目的物离子取代下来。

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