高效液相色谱知识分享

总述：根据样品在流动相和固定相中的分配系数的不同将组分分离开来，依次通过紫外检测器检测，再通过色谱工作站输出色谱流出曲线，依据色谱流出曲线我们可以得到：“色谱峰个数——组分最少个数；保留值——定性分析；面积、峰高——定量分析；保留值、区域宽度——判断色谱柱的分离效能；两峰间的距离——评价固定相、流动相的选择及配比是否合适”等信息。

下面从以下几方面进行阐述（原理、设备、注意事项）： I．概论

一、液相色谱理论发展简况 1、色谱法的诞生

色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 2、HPLC的特点和优点 2.1 HPLC有以下特点：

高压-压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速-流速为0.1~10.0 ml/min。

高效-可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 2.2 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：

速度快-通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。 分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。 柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。

样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 二、基本概念和术语 1．色谱图和峰参数

1.1 色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。

1.2 基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。

1.3 噪音(noise)--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。

1.4 漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。

1.5 色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。 1.6 峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。 1.7 峰底-基线上峰的起点至终点的距离。

1.8峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ；它由组分在色谱柱中性质和扩散行为决定，即色谱过程动力学决定。

1.9 半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。Wh/2＝2.355σ。 1.10 标准偏差（standard deviation，σ)-正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。 1.11 峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。 2．定性参数（保留值）

死时间(dead time，t0)--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。 死体积(dead volume，V0)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速）

保留时间(retention time，tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。 保留体积(retention volume，VR)--从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出 溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F×tR

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调整保留时间(adjusted retention time，t'R)--扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reduced retention time)。在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'R只决定于组分的性质，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0

调整保留体积(adjusted retention volume，V'R)--扣除死体积后的保留体积。 3．柱效参数

理论塔板数(theoretical plate number，N)--用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。

N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。） 4．相平衡参数

物质在固定相和流动相之间发生的吸附、脱附和溶解、挥发的过程叫做分配过程。分配系数(distribution coefficient，K)--在一定温度、压力下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。

在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。

分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。 在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度很低时(Cs、Cm很小)时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。

在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。

选择性因子(selectivity factor，α)--相邻两组分的分配系数或容量因子之比。α又称为相对保留时间（《美国药典》）。要使两组分得到分离，必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。 5．分离参数

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