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（3）取未知溶液2.0ml于10ml比色管中，其中一份加入1.0ml pH=5.5的HAc-NaAc缓冲溶液，另一份加入1.2ml0.1mol/L的NaOH水溶液，以蒸馏水稀释至刻度，摇匀。

2．荧光激发光谱和发射光谱的测定：测定（1）中第三份溶液和（2）中第三份溶液各自的激发光谱和发射光谱，先固定发射波长为400nm，在250-350nm区间进行激

max发波长扫描，获得溶液的激发光谱和荧光最大激发波长?maxex；再固定激发波长?ex，

在350-500nm区间进行发射波长扫描，获得溶液的发射光谱和荧光最大发射波长

maxmax?maxem。此时，在激发波长?ex处和发射波长?em处的荧光强度应基本相同。

3.荧光强度测定：根据上述激发光谱和发射光谱扫描结果，确定一组波长（?em和

x?em），使之对二组分都有较高的灵敏度，并在此组波长下测定前述标准系列各溶液

和未知溶液的荧光强度If。 五．仪器操作步骤：

注意：1、工作曲线的测定和未知液测定时应保持仪器设置参数的一致； 2、开机时先开氙灯再开计算机；关机时先关计算机再关主机电源； 六、结果处理：

以各标准溶液的If为纵坐标，分别以邻-羟基苯甲酸或间-羟基苯甲酸的浓度为横坐标制作工作曲线。根据pH=5.5的未知液的荧光强度，可以从邻-羟基苯甲酸的工作曲线上确定邻-羟基苯甲酸在未知液中的浓度；根据pH=12时未知液的荧光强度与pH=5.5时未知液的荧光强度的差值，可从间-羟基苯甲酸的工作曲线上确定未知液中间-羟基苯甲酸的浓度。 七、思考题：

maxmaxmax1、?maxex、?em各代表什么？为什么对某种组分其?ex和?em处的荧光强度应基本相

同？

2、从实验可以总结出几条影响物质荧光强度的因素？

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实验十六 二氯荧光素最大激发波长和最大发射波长的测定

一、实验目的

1．掌握二氯荧光素最大激发波长和最大发射波长的测量方法； 2．学会辩别荧光物质的分子荧光峰和拉曼散射峰；

3．熟悉分子发光光度计的定性扫描方法及定性测量软件数据处理操作。 二、实验原理

任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱。由于斯托克斯位移，荧光发射波长总是大于激发波长。并且，由于处于基态和激发态的振动能级几乎具有相同的间隔，分子和轨道的对称性都没有改变，荧光化合物的荧光发射光谱和激光谱形式呈大同小异的\镜象对称\关系。

荧光激发光谱是通过测量荧光体的发光通量随波长变化而获得的光谱。它是荧光强度对激发波长的关系曲线，它可以反映不同波长激发光引起荧光的相对效率；荧光发射光谱是当荧光物质在固定的激发光源照射后所产生的分子荧光，它是荧光强度对发射波长的关系曲线。它表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。由于各种不同的荧光物质有它们各自特定的荧光发射波长值，所以，可用它来鉴别各种荧光物质。

可以依据绘制其激发光谱曲线时所采用的最大激发波长值来确定某荧光物质的分子荧光波长值和绘制荧光光谱曲线。同一荧光物质的分子荧光发射光谱曲线的波长范围不因它的激发波长值的改变而位移。由于这一荧光特性，如果固定荧光最大发射波长（λem），然后改变激发波长（λex），并以纵坐标为荧光强度，横坐标为激发光波长绘图即获得激发光谱曲线，从中能确定最大激发波长（λex）。反之，固定最大激发光波波长值，测定不同发射波长时的荧光强度，即得荧光发射光谱曲线和最大荧光发射波长值。

三、仪器和试剂

分子荧光光度计。它的主要技术指标如下：测量波长范围：200-650 nm、光源：脉冲氙灯、测量模式：激发光谱，发射光谱，波长同步光谱，能量同步光谱、测量方式：定性、定量、三维扫描、荧光动力学

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四面通石英比色皿一个（10mmx10mm）、10 mL具塞比色管、1mL/2 mL移液管、吸尔球、洗瓶、镜头纸

二氯荧光素（0.50μg/mL）标准工作溶液(内含1mol/L 氢氧化钠 5mL 和1mol/L 盐酸3ml)、 二次蒸馏水

四、实验步骤

1．配制浓度为0.50μg/mL的二氯荧光素溶液，准备好实验所需的器皿工具。 2．打开计算机、打印机和荧光光度计主机，预热5分钟。 3．对荧光光度计进行仪器初始化。

4.选择定性扫描模式。安装测量参数。依次在激发波长值分别为350nm/340nm/360nm，波长扫描范围为200-650nm，激发和发射波长狭缝宽度分别为 5nm，响应时间为10nm，扫描速度为1000时预扫描二氯荧光素的各发射光谱图，并且通过叠加的三份谱图分析和确定二氯荧光素的荧光发射峰。再确定最大发射波长值。

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实验十七 分子荧光法测定奎宁的含量

一、实验目的

1、学习荧光光度法测定奎宁的方法 2、熟练荧光光度计的使用 二、实验原理

奎宁在稀酸溶液中是强荧光物质，它有两个激发波长250mm和350mm ,荧光发射峰在450nm。在低浓度时，荧光强度与荧光物质量浓度成正比。

If?k?c三、仪器与试剂

1、岛津RF?5301PC分子荧光光度计，适用玻璃仪器等。 2、100.0 ug·ML-1奎宁贮备液 10.0kg·mL-1奎宁标准溶液 3、0.05molL-1H2SO4溶液。 四、实验内容

1、标准溶液的配制 0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ug mL-1溶液 2、绘制激发光谱和荧光发射光谱220～400mm 扫描激发光谱，400～600mm扫描荧光发射光谱

3、绘制标准曲线，激发浓长350mm (或250mm)荧光发射浓长450mm。 4、未知试样的测定，测定一个标准曲线浓度范围内的未知浓度奎宁溶液。 五、注意事项

奎宁溶液必须当天配制，避光保存。 六、思考题

1、能否用0.05mol·L-1HC1来代替0.05mol·L-1 H2SO4稀释溶液？ 2、如何绘制激发光谱和荧光发射光谱？

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实验十八 水中pH值的测定（玻璃电极法）

一、实验目的

1. 通过实验加深理解pH计测定溶液pH值的原理；

2. 掌握pH计测定溶液pH值的方法。 二、实验原理

电位法测定溶液的pH值，是以玻璃电极为指示电极（－），饱和甘汞电极为参比电极（＋）组成电池。25℃时，溶液的pH值变化1个单位时，电池的电动势改变59.0mV。实际测量中，选用pH值与水样pH值接近的标准缓冲溶液，校正pH计（又叫定位），并保持溶液温度恒定，以减少由于液接电位、不对称电位及温度等变化而引起的误差，测定水样之前，用两种不同pH值的缓冲溶液校正，如用一种pH值的缓冲溶液定位后，在测定相差约3个pH单位的另一种缓冲溶液的pH值时，误差应在±0.1pH之内。

校正后的pH计，可以直接测定水样或溶液的pH值。

三、仪器与试剂

仪器：各种型号的pH计

试剂：0.05mol/L邻苯二甲酸氢钾标准缓冲溶液 0.025mol/L混合磷酸盐缓冲溶液 NaH2PO4溶液 约0.1mol/L

四、实验内容

1. 按照仪器说明书的操作方法进行操作。

2. 将电极与塑料杯用蒸馏水冲洗干净后，用标准缓冲溶液淋洗1～2次，用滤纸吸干。

3. 用标准缓冲溶液校正仪器。 4. 水样或溶液pH值的测定。

（1）用蒸馏水冲洗电极3～5次，再用被测水样或溶液冲洗3～5次，然后将电