蛋白质的表达、分离、纯化实验流程

蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。

实验步骤

一：材料准备

1. 实验材料：大肠杆菌 BL21、LB 液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠

2. 实验仪器：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒

二：实验操作

1. 试剂准备： 2.

2. 获得目的基因

① PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。

②通过 RT-PCR 方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总 RNA，以 mRNA 为模板，逆转录形成 cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行 PCR 循环获得产物。

3. 构建重组表达载体

①载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收 Kit 或冻融法回收载体大片段。

② PCR 产物双酶切后回收，在 T4DNA 连接酶作用下连接入载体。

4. 获得含重组表达质粒的表达菌种

①将连接产物转化大肠杆菌 DH5α，根据重组载体的标志（抗 Amp 或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

②测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

③以此重组质粒 DNA 转化表达宿主菌的感受态细胞。

5. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导

①接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌 BL21 菌株于 5 mL LB 液体培养基中（含 100 ug/mL 氨苄青霉素），37 ℃震荡培养过夜。

②按 1:50 或 1:100 的比例稀释过夜菌，一般转接 1 mL 过夜培养物于 100 mL（含 100 ug/mL 氨苄青霉素）LB 液体培养基中，37 ℃震荡培养至 OD600 = 0.6 - 0.8（最好 0.6，大约需 3 h）。取 10 ul样品用于 SDS-PAGE 分析。

③对照组不加诱导剂，实验组加入 IPTG 至终浓度 0.5 mmol/l，37 ℃继续培养 1～3 h。 ④ 12 000 rpm 离心 10 min，弃上清，菌体沉淀保存于 -20 ℃或 -70 ℃冰箱中。

6. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化 ① NTA 层析柱的准备：在层析柱中加入 1 mL NTA 介质，并分别用 8 mL 去离子水，8 mL 上样缓冲液洗涤。

②重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入 5 mL 上样缓冲液，用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品 60 min，4℃ 12 000 rpm 离心 30 min，将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取 10 ul上清样品用于 SDS-PAGE 分析。 ③上清样品以 10～15 mL/h 流速上 Ni2+-NTA 柱，收集流出液，取 10 ul样品用于 SDS-PAGE 分析。

④洗脱杂蛋白：用 Washing Buffer 以 10～15 mL/h 流速洗柱，直至 OD280 = 0.01 分步收集洗脱液，约 3～4 h，取 10 ul洗脱开始时的样品用于 SDS-PAGE 分析。

⑤洗脱目标蛋白：用 Elution Buffer 洗柱，收集每 1 mL 级分，分别取 10 ul样品用于 SDS-PAGE 分析。