陈阳松

溶液稀释与配比

C1V1=C2V2：万能稀释公式，一般母液和终浓度比不为X:1用这个公式计算。X/1：当母液与终浓度比为X：1时用这个快速方法，此时方法为把母液分为1，剩下的用总比例减掉，如：X2（1:1）， X6（1:5），X10（1:9）。

百分数和mol数转以1%盐浓度进行转换

换设是100克的此溶液，则有99克的水和1克的盐（NaCl），盐的物质的量为1/58.5=0.017mol，水体积为99mL=0.099L，所以物质的量浓度为0.017/0.099=0.17mol/L，即摩尔浓度为0.17mol/L

1%=1g/100g (1/58.5)/0.099

1. 各成分作用

CTAB法提取DNA

CTAB：溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； Tris-HCl (pH8.0)：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA：螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl：提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，在于液相中；

β-巯基乙醇：抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除；

PVP(聚乙烯吡咯烷酮)：酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚。 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

2. 操作步骤

陈阳松

打样

新鲜叶片，转速220r/min，1min，打样时管身全部冻着，而且放在打样机的时候保证盒子里面得有液氮，这样样品才能充分打碎，写字的朝向一致，以便认字

提取

1) 称取0.1g(约3-4片)新鲜叶片，液氮中研磨成粉末，加入800ulCTAB缓冲液轻轻摇匀，65°C水浴（烘箱）保温30min左右； 备注

用2ml管提取时，加完CTAB在本子上记录好每个样品的名字，防止后面漏管和裂管时查找被抹掉的号，这样可以防止在侧壁写管的麻烦； 在等待的过程时，即可拿出1.5ml离心管加入异戊醇做好准备；写字的朝向一致，以便认字

2) 冷却（放冰箱）至室温后，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）盖上瓶盖，温和摇动，使成乳状液。 备注

一定要冷却，不然的话，热涨后盖子盖不紧，

此处必须摇匀，不然会因为分层不明显，表面容易起一层油状层； 3) （按照管盖的的朝向，在加完异戊醇的管上写上对应样品名字，字迹要大，以防相同的数字出现如81/18，以及即使掉了一些也还有一部分可以识别） 4) 8000rpm 10min ,离心管中出现三层，小心吸取含有DNA的上清液

（400-500ul）到新的1.5ml离心管中。根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇重复抽提1-2次； 备注

吸上清液时，按照前面写好的顺序，打开盖，同时打开异丙醇的盖，可以检查哪些漏掉，一旦发现漏掉的，立马盖上盖子，吸完别的后平躺着吸这管

吸上清时，枪头不要挨着最深处的上清液，挨着上面那个片层处吸，能吸多少吸多少

5) 在上清液中，加入0.7倍/等体积的异丙醇（400-500ul），颠倒混匀，放

-20入冰箱不少于20min；

陈阳松

备注：倒废液时，用空板一排一排倒

6) 8000rpm 离心10min，弃上清；加600ul的70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几

分钟，8000rpm 离心5min，除去乙醇，即为DNA粗制品；

备注：倒扣在卫生纸上，可以干得更快，40min左右即可拿出，迅速加水溶解，37摇床,67r，1h

3. 注意事项

1) 吸取上清液时一定要小心，必要时减掉枪头顶端；

2) 在倒废液时，找一个管架，盖子打开后朝里侧将其尽量合拢，管口朝外，

扣住管架后，一起倒掉废液，这样可以避免液体毁掉管上的字； 3) 在盖盖时，拇指按住盖，找准方向按下去；