实验一：大肠杆菌DH5α和BL21感受态细胞的制备

【实验步骤】

1 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌DH5α单菌落，接种到5mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜。

2 取1mL培养物接种到100mL LB培养基（250mL三角瓶）中，37℃振荡培养2~3h。 3 将菌液转移到50mL离心管（2管）中，冰上放置15min。 4 4℃ 4000 rpm 离心5min，弃去上清液，倒置使培养液流尽。

5 用20 mL 冷CaCl2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4℃ 4000 rpm 离心5min，弃去上清液。

6 用10 mL 冷CaCl2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30min。

7 4℃ 4000 rpm 离心5min，弃去上清液，用2 mL的冷CaCl2溶液悬浮。 8 分装到数个EP管中，每管200 uL，冷冻保存备用。

实验二：目的基因质粒（T-SOD或T-IL218）

和表达载体质粒（PET32或PET30）的转化及大量提取

【实验步骤】

一、载体的转化（无菌条件，冰上进行） 1、取200 uL 新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒DNA 2 uL（PET32a，IL-18），混匀，冰上放置30min。

2、将EP管放到42℃ 保温90s，冰浴 2min。

3、加入800uL LB液体培养基，37℃慢摇复苏1 h。

4、将100 uL 的复苏细胞涂布在含有Amp（100mg/mL）的LB培养皿中，正置平皿30min（使菌液被培养基吸收）。

5、倒置平皿37℃培养16 h，出现菌落。 二、质粒的提取

1 挑取单菌落接种于100 mL 加入50uL Amp 的LB液体培养基中，振荡培养过夜。

2 过夜培养的菌液加入1.5 mL的小指管（20个每组）中，每次1 mL，4℃，12000 rpm，离心1min，4次，弃上清。

3 加入150uL溶液Ⅰ悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10min。

4 加入350uL溶液Ⅱ（新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5min。（不能再剧烈震荡） 5 加入300uL溶液Ⅲ（冰上预冷），颠倒混匀20次，不能剧烈震荡，冰浴10min。 6 4℃，12000 rpm，离心10 min，取上清转移至另一离心管中。 7 向上清中加入0.6倍异丙醇，轻轻混匀，室温静置20 min。

8 4℃，12000 rpm，离心10 min，弃上清，倒扣于吸水纸上，吸净液体。

9 用1mL 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀2次，每次4℃，12000 rpm，离心3min，吸去上清。 10 55℃烘干至无酒精，加入20uL TE，所有集成一管后加入RNase 1~2uL，37℃消化1~2h，-20℃保存。

11 电泳分析。制胶：0.14g琼脂糖，20mL 1×TBE缓冲液，溶解后倒入制胶板，放入梳子，冷却凝固待用。点样：6uL质粒+1uL上样缓冲液。电压：180V，电泳至蓝色带距离点样孔3cm。

实验三 目的基因质粒和表达载体质粒的酶切及其产物的分离纯化

【实验步骤】 1 酶切

酶切体系

试剂 小量酶切 大量酶切

灭菌水 5uL — 质粒 10uL 88uL EcoRⅠ 0.5uL 1uL HindⅢ 0.5uL 1uL 10×Tango buffer 4uL 10uL 终体积 20uL 100uL 按以上酶切体系加入0.5 mL EP管中，37℃放置3h，电泳回收片段。 （点样：酶切体系100uL+上样缓冲液20uL。） 2 酶切产物的回收

1) 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分放入干净的离心管中，

称取重量。

2) 向胶块中加入3倍体积溶胶液（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100uL，则加入300uL

溶胶液），50-55℃水浴放置10min，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

注意：溶胶时，如果溶胶液变为红色（正常情况下为淡黄色），可向含有DNA的胶溶液中加10-30uL 3N醋酸钠（pH5.2）将溶液调为淡黄色，否则将会影响DNA与吸附柱的结合，影响回收效果。

3) 将上一步所得的溶液加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），13，000rpm 离心

30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。

4) 向吸附柱中加入700uL漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），13，000rpm 离

心30-60s，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

5) 向吸附柱中加入500uL漂洗液，13，000rpm 离心30-60s，倒掉废液。

6) 将离心吸附柱放回收集管中，13，000rpm 离心2min，尽量出去漂洗液，将吸附柱开盖

于室温1-2min，彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

7) 将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65-70℃预热的洗

脱液，室温放置2min。13，000rpm 离心2min收集DNA溶液。 8) DNA产物-20℃保存。

完毕后电泳检测回收与纯化效果：DNA回收纯化后，电泳检测应为单一的一条带，如果切胶过程中不慎带上染带，回收后电泳结果可能会出现两条以上的带，这时应重复上述方法进行回收与纯化。

实验四 目的基因与表达载体的重组及重组子的筛选与鉴定

【实验步骤】

1载体与目的基因的连接

1) 在一1.5mL EP管中加入2uL酶切后的载体DNA与6uL目的DNA片段。 2) 添加1uL的10×buffer以及1uL的T4DNA连接酶，总体积10uL。 3) 16℃水浴条件下保温过夜连接。 2感受态细胞与连接产物的转化 1) 取感受态细胞BL21（实验一制备） 200uL，加入6uL连接产物，轻轻用枪吹打混匀（不

可震荡）。 2) 冰浴30min。

3) 热激：42℃保温90S，冰浴2min。

4) 加入800ul LB培养基，37℃慢慢复苏30min。

5) 将复苏菌液4000r/min离心1min，先吸去800μL上清，再将细胞吹散成细胞悬液，取

50μL细胞悬液直接涂布在含氨苄青霉素（Amp）100ug/ml、X-gal和IPTG的LB选择平板上。

6) 将平板正向放置30min左右至液体被吸收，倒置平板37℃培养16—20h出现菌落，其

中白色为重组质粒。

3 重组子的鉴定（蓝白斑筛选，小提质粒比大小和酶切分析）

1）将白色单菌落接入3mL 含抗生素（Amp）的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。 2）按实验二的方法提取质粒DNA，20uL RTE溶解DNA沉淀。 3）双酶切质粒DNA 20uL 体系，方法同上。

4）1%琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒和它的酶切产物。

（酶切鉴定重组子可见重组成功的重组子有两个条带：一为切为线性的PET32a质粒条带，一为目的基因条带。）

实验五 目的基因在大肠杆菌中的诱导表达及表达产物的SDS-PAGE分析

实验I 、外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

【实验步骤】

1. 分别挑取白斑菌落（重组菌株）、蓝斑菌落（非重组菌株）于5ml 含AMP的LB液体培养基中，37℃，190r/min振荡培养过夜(注意取菌株要在超静工作台上操作，一定注意无菌)。 2.分别取过夜培养菌1ml接种到5ml含AMP的LB液体培养基中（蓝，白斑各3管，作好标记），于37℃摇床培养4h左右，达到1个OD值。

3.因为诱导剂IPTG的量,诱导条件,诱导时间，培养基成分都可影响诱导表达，所以可按如下6组设计培养 摇瓶时间（t/h） 5 5 5 5 5 5 IPTG/ul 7 7 7 7 7 7 温度T/℃ 32 37 42 32 37 42 样液 白 白 白 蓝 蓝 蓝

4.分别取 6支试管按上述表格控制条件,摇瓶培养5h。

5. 取1ml摇瓶后菌液于离心管，共6支，4℃低温离心，12000 r/min，5 min，收获菌体，弃上清，取沉淀（菌体可放-20℃存放备用）。

6.向每支试管沉淀均加入200μL TE液，将细胞悬浮。

7. 每管加入200μL 2 X SDS buffer。开水煮沸5min，再冰浴2min，4℃,12000 r/min，5 min，取上清液做凝胶电泳。 8.观测结果及分析（实验Ⅱ）。

实验Ⅱ SDS-PAGE检测表达蛋白

【实验步骤】 1． 配制分离胶 分离胶配方 双蒸水 分离胶缓冲30%胶贮液 10%SDS TEMED 10%AP 液 6.7ML

5ML 8ML 200μL 15μL 150μL