课题3 血红蛋白的提取和分离

【学习目标】1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白 2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理 【学习重点】凝胶色谱法的原理和方法

【学习难点】样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填 1．基础知识

蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。 1．1凝胶色谱法（分配色谱法）：

（1）原理：（图5－13a）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。 （2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 （3）分离过程：（图5－13b）

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子 【补充】洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 1．2缓冲溶液

（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。 （2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。 1．3凝胶电泳法：

（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 ［思考］阅读教材后，填写下表：

电荷性质 电荷量 分子形状 分子大小

（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。

（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 2．实验设计

2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？ 样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。

【思考】：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？

决定运动方向 形成库仑力 √ √ 形成阻力 √ √ 决定运动速率 √ √ √ 不是。因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。 2.2选择实验材料

（1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？ 哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。

（2）请阅读教材，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题： 血液由 血浆 和 各种血细胞 两部分组成。

血细胞中 红细胞 细胞数量最多，细胞的含量中，除水以外，最高的化合物是血红蛋白 。 该化合物是由 两条α-肽链 和 两条β-肽链 构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的 亚铁血红素 基团。

2.3从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。洗涤红细胞的目的是什么？

除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。 红细胞的洗涤过程为

血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水 →缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色

【思考】：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？ 防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。 【思考】：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？ 加入蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。

【补充】：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。 加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。 2.4如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？

透析。半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。 思考：为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？ 维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。

2.5凝胶色谱分离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。 （1）根据教材图5－19，说出制作色谱柱需要的材料。 （2）色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱 （3）凝胶色谱柱的装填。请阅读教材： 色谱柱的装填过程。

步骤 ① ② ③ 操作要求 计算称量凝胶 配制悬浮液 操作要求 色谱柱垂直固定在支架上 根据色谱柱体积计算凝胶用量 凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀 凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴 ④ ⑤ 装填悬浮液 缓冲液洗涤平衡 一次性缓慢倒入；轻轻敲打 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h （4）样品加入和洗脱。其基本过程是： 调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质 3.操作提示

（1）红细胞的洗涤：

洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 （2）凝胶的预处理：

沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡 （3）色谱柱的装填：

装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 （4）色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。 【实例探究】

例1 利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来（ ） A. 相对分子质量大的

B. 溶解度高的 C. 相对分子量小的

D. 所代电荷多的

例2 蛋白质提取和分离分为哪几步（ ）

A. 样品处理、凝胶色谱操作、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 B. 样品处理、凝胶色谱操作、纯化

C. 样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定

D. 样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定

例3用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（ ） A路程较长，移动速度较慢 B路程较长，移动速度较快

C路程较短，移动速度较慢 D路程较短，移动速度较快 【巩固练习】

1. 凝胶色谱法分离蛋白质的依据是（ ）

A. 对其他分子的亲和力 B. 溶解度