分子生物学实验教案

实验3 琼脂糖凝胶电泳检测DNA

【时间安排】：3学时 【实验类型】：基本训练 【目的要求】：

1、 了解：琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理； 2、 掌握：琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法； 3、 熟悉：琼脂糖凝胶电泳检测DNA的操作过程。

【实验原理】：

琼脂糖凝胶电泳是检测DNA的常用方法。琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取，是一种聚合链线性分子，实验室中常用两种琼脂糖，即常熔点的和低熔点的，它们都是琼脂的衍生物，具有很高的聚合强度和很低的电内渗，都是良好的电泳支持介质。

核酸分子是两性解离分子，在pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷酸基团中只有第一个磷酸解离，整个核酸分子带正电荷，在电场中向负极泳动；在pH值为8.0～8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动。不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于DNA分子的电荷密度大致相同，即相同数量的链DNA几乎具有等量净电荷，它们以同样速度向正极移动，因此，在一定电场强度下，DNA分子的移动速率取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片断泳动速度不一样，可进行分离。其迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。

凝胶不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对质量相同，但构型不同的DNA分子。如抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使提取的质粒可能存在三种构型：①超螺旋的共价闭环状质粒（CC）；②解旋开环质粒DNA（OC）；③线状质粒DNA（L）。电泳中，泳动最快的是CC，其次为L，最慢的为OC。

DNA在琼脂糖中的电泳迁移速率主要取决于：样品DNA分子大小、DNA分子构象、琼脂糖浓度、电场电压、缓冲液、温度等。

加入EB，并将已知浓度的标准样品和已知分子量大小的标准DNA片断（即marker）作琼脂糖凝胶电泳对照，可分别检测样品的浓度和分子量大小。

【仪器与试剂】：

主要仪器：微波炉、稳压电泳仪、电泳槽、紫外灯箱、三角瓶、量筒、微量移液器、离心管、记号笔等；

主要试剂：实验1提取的质粒样品、溴化乙锭、溴酚兰、电极缓冲液、琼脂糖、上样缓冲液、标准DNA marker。

【重要实验步骤和教学设计】： 1、 准备好制胶板，封边防漏。

2、 根据所需浓度称取一定量的琼脂糖，加入适量的0.5×或1×TBE或其它电泳缓冲液，微

波炉加热或沸水裕使琼脂糖溶解。

3、 等凝胶温度降到55℃～60℃时，加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5μL/ml，摇匀。

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4、 将琼脂糖倒入制胶板中，凝胶厚度一般为0.3～0.5cm，迅速插上梳子，检查有无气泡。 5、 凝胶充分凝固后，小心取出梳子，并撤除两端封边挡板。

6、 将凝胶放置于电泳槽中，加入相应的电泳缓冲液，使液面略高于胶面。

7、 在DNA样品中加入1/6的上样缓冲液，混匀后，稍离心，然后用移液器将DNA样品加

入样品孔中。 8、 接通电源，选择适当电压和电泳方向，使DNA样品由负极向正极电泳。 9、 当指示剂接近凝胶末端时，切断电源，停止电泳。 10、取出凝胶，在紫外灯下观察，摄像。

【实验注意事项】：

1、 制作琼脂糖凝胶时，要戴手套，不要滴洒在台面或地面，千万不要触碰溴化乙锭（EB），

因为它是癌变的强烈诱变剂，用后用水彻底冲洗干净；

2、 加样时不要慌，不要抖动，以免碰裂加样孔导致各个加样孔中的DNA相互渗透 3、 观看电泳结果时不要拥挤，认真辨认是否提取到了目的质粒DNA。

【思考题】：

1、 DNA电泳方向与pH值有什么关系？在一定电场强度下，DNA分子的移动速率取决于

分子筛效应？

2、 DNA在琼脂糖中的电泳迁移速率与样品DNA分子大小、DNA分子构象、琼脂糖浓度、

电场电压、缓冲液、温度等有什么样的关系？

【实验后记】：

实验4 PCR扩增获取目的基因

【时间安排】：3 学时 【实验类型】：设计 【目的要求】：

1、 了解：PCR反应的基本原理和引物设计的一般要求； 2、 掌握：通过PCR反应获取目的基因的实验技术；

3、 熟悉：PCR反应体系的加样顺序和PCR仪的正确使用方法。

【实验原理】：

获取目的基因是非常艰巨的工作，通常要求：靶基因表型明确；单个靶基因编码优良性状或疾病基因；靶基因是一对等位基因控制的显性基因；容易获得目的基因的突变体和重组子等。但通过设计合理的基因克隆策略还是可以分离获得目的基因的。使用的方法通常有：PCR扩增法、核酸探针筛选法、免疫反应筛选法、酶活性筛选法、差示杂交法、DNA标签法、染色体巡查法（chromosome walking）、图位克隆法、酵母双杂交法等等。

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聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。分三步：①变性，通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火，当温度降低时由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少；③延伸，在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg存在的条件下，5′→3′的聚合酶催化以引物为起始点DNA链延伸反应。以上三个步骤为一个循环，每一循环产物可作为下一个循环的模板，几十个循环后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到大量复制，可达2

6～7

×10拷贝。

引物的设计在PCR反应中极为重要，应遵循几条原则：①碱基组成，G﹢C含量应在40～60%，4种碱基要在引物中分配均匀，如没有多聚嘌呤或多聚嘧啶的序列，并且没有二核苷酸重复序列；②长度，18～25个核苷酸，上下游引物的长度差别不能大于3bp；③不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列的存在，这种序列可能成发夹结构，如果是这种结构在PCR条件下稳定，它会非常有效地组织寡聚核苷酸和靶DNA之间的复性；④一个引物的3′末端都不能和其他任何引物互补，否则会形成引物二聚体。精心设计引物，应用热启动PCR或降落PCR或特制的DNA聚合酶都可以避免二聚体形成；⑤解链温度（Tm）：计算出两个引物的Tm值相差不能大于5℃，扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10℃，这些特性保证了扩增产物在每个PCR循环可有效地变性；⑥3′末端，每个因为的3′末端碱基应尽可能为G或C，但又不推荐使用3′末端有……NNCG或……NNGC序列的引物，因为末端GC碱基高的自由能可以村级发夹结构的形成，还可能产生二聚体；⑦向引物5′末端添加限制性酶切位点，噬菌体启动子等序列，因为位于DNA分子5′末端的限制性酶切位点的切割效率比较低，所以，引物应当超出限制性内切酶识别位点2－3个核苷酸，即至少包含有2－3个保护碱基；⑧从cDNA或基因文库中PCR扩增目的基因时，应注意引导位点的设置和简并PCR引物的设计。

本实验已知目的基因是在质粒pUCATPH中的抗潮霉素基因，见图1

2+

图1 抗潮霉素基因（黑色部分）

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分子生物学实验教案 已知抗潮霉素基因序列为：

1 atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac

61 agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 121 gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 181 cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 241 ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 301 caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 361 gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 421 atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 481 cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 541 ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 601 tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 661 atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 721 tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 781 cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 841 ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 901 gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 961 tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1021 gaatag

要求通过PCR技术将目的基因扩增出来，关键是引物设计，在设计引物时要考虑到后续实验中的DNA酶切、连接和转化等，所用的克隆载体为pBSKS，见图2

图2

【仪器与试剂】：

主要仪器：微量移液器、PCR仪、离心机、微波炉、电泳槽、电泳仪、紫外灯箱等。

主要试剂：模板DNA、质粒DNA、引物、Tag酶及其他PCR反应体系的成分、DNA标准Marker、进口琼脂糖、TE、上样缓冲液、乙醇等。

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