分子生物学实验教案

【实验注意事项】：

1、 在进行诱导实验中要注意以含有空载体pET 28c的BL21菌株以及IPTG诱导前的含有

pET 28c重组子的BL21菌株做对照。

【思考题】：

1、 IPTG是如何诱导目的基因表达的？

2、 有人说克隆基因相对比较容易，使外源基因表达尤其是高效表达就比较难，你认为呢？

【实验后记】：

实验14 SDS-PAGE检测目的蛋白

【时间安排】：3 学时 【实验类型】：综合

【目的要求】：

1、 了解：聚丙烯酰铵凝胶电泳的基本原理； 2、 掌握：SDS-PAGE检测目的蛋白的实验技术；

3、 熟悉：SDS-PAGE试剂配制、蛋白质提取的实验过程。

【实验原理】：

电泳是带电颗粒在电场的作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象，影响泳动速度的因素主要有颗粒的性质、电场强度和溶液的性质等。聚丙烯酰铵凝胶（PAG）是常用的电泳介质，它是由单体丙烯酰铵（acrylamide）和交联共聚单位双体N，N-甲叉双丙烯酰铵位材料，在引发剂过硫酸铵（APS）和增速剂四甲基乙二胺（TEMED）的作用下聚合交联形成含酰胺基侧链的脂肪族长链，在相邻长链之间通过甲叉桥连接而成的三维网状结构物质。 SDS-PAGE（即十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰铵凝胶电泳）主要用于分离蛋白质和测定蛋白质亚基分子量。SDS是一种阴离子去污剂、变性剂、助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键和疏水键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；还原剂，如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚成单个亚基。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带有负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。使蛋白质分子的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。SDS电泳成功的关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质和SDS的结合程度，其影响因素主要是：（1）溶液中SDS单体的浓度；（2）样品缓冲液的离子强度；（3）二硫键是否完全被还原。

SDS-PAGE具有浓缩效应（不连续缓冲系统）；电荷效应；分子效应等。

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分子生物学实验教案 【仪器与试剂】：

主要仪器：电泳仪、蛋白电泳槽、制胶板、电炉、离心机、水浴锅、台式脱色摇床、冰箱、冰盒、制冰机等

主要试剂：蛋白质标准分子量、APS、TEMED、Tris、SDS、Glycine、Acrylamide、bis、盐酸、考马斯亮蓝R-250、甲醇、冰醋酸、甘油、溴酚蓝、DDT、β巯基乙醇等。

【重要实验步骤和教学设计】：

1 样品蛋白质提取：将IPTG诱导前的样品及诱导后的样品（包括诱导1、2、3、4、5小

时的样品），5000rpm离心5min，得上清液和沉淀。沉淀中分别加入200μL冰预冷的磷

酸缓冲液（pH7.4）悬浮细胞，洗涤后5000rpm离心5min，回收菌体沉淀，加入30μL Ph7.4的PBS缓冲液盒10μL的4X SDS loading buffer，剧烈振荡悬浮溶解菌体；上清液30μL，添加10μL的4X SDS loading buffer，混匀。将上清液和沉淀样品分别在100℃沸水中5min，立即放入冰箱或冰浴中冷却。 2 SDS-PAGE母液配制：

（1）30％Acr-Bis贮液：称取30克丙稀酰胺和0.45克甲叉双丙稀酰胺，加双蒸水溶解后定容到100mL。过虑后使用。4℃下可存放1个月左右。

（2）分离胶缓冲液(0.57M pH=8.8 Tris-HCl)：称取20.7g Tris，用少量水溶解后，以1N HCl调pH=8.8后，定容到100mL。4℃下存放。

（3）浓缩胶缓冲液(0.18M pH=6.8 Tris-HCl)：称取4.36g Tris，用少量水溶解后，以1N HCl调pH=6.8后，定容到100mL。4℃下存放。

（4）10％SDS：10克SDS溶解于100mL水中，室温存放。

（5）10％过硫酸铵：100毫克过硫酸铵溶解于1mL水中，一周内使用。

（6）电极缓冲液(pH=8.3)：称取15克Tris，72克甘氨酸和5克SDS，溶解于适量水中后，以1N HCl调pH=8.3后，定容到1000mL。4℃下存放。用前稀释5倍。

（7）样品提取液：4.2 mL dH2O + 1 mL 0.5M Tris-HCl(pH=6.8) + 0.8mL 甘油 + 0.4mL 巯基乙醇 + 1.6mL 10% SDS——8mL

（8）1N HCl：8.5mL 36% HCl (比重1.19) 加水定容至100mL。

3 制胶：

（1）10％分离胶配方： （2）3.6％浓缩胶配方： 30％Acr-Bis贮液 10 mL 30％Acr-Bis贮液 2 mL 分离胶缓冲液 10 mL 浓缩胶缓冲液 5 mL 10％SDS 0.3 mL 10％SDS 0.1 mL 10％过硫酸铵 50~100μL 10％过硫酸铵 30~70μL TEMED 40μL TEMED 20μL ddH2O 8 mL ddH2O 2.5 mL 总体积 30 mL 总体积 10 mL 4 点样和电泳：点样量10~20μL，8~20mA恒流，直至溴酚蓝标记离开分离胶。 5 染色：凝胶经0.04%考马斯亮蓝R-250、12%三氯乙酸染色1~2天后，用自来水脱色。

【实验注意事项】：

1、 提取样品蛋白要严格按照程序进行；

2、 注意凝胶储液浓度，特别是含有几种药品的溶液，不能弄错； 3、 制胶、剥胶要小心，保持凝胶的完整性； 4、 电泳方向要准确，电流要适当。

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分子生物学实验教案

【思考题】：

1、 实验过程中存在什么问题？原因在哪？ 2、 是否检测到目的蛋白，为什么？

【实验后记】：

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