苯、萘、联苯的高效液相色谱分析及柱效能的测定
一、目的要求
1．学习高效液相色谱保留值定性、外标法定量分析方法。
2．了解高效液相色谱仪基本结构和工作原理，以及初步掌握其操作技能 3．学习柱效能的测定方法
二、实验原理
高效液相色谱的定性和定量分析，与气相色谱分析相似，在定性分析中，采用保留值定性，或与其它定性能力强的仪器分析法（如质谱法、红外吸收光谱法等）联用。在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、内标法或外标法等。
气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式，同样适用于高效液相色谱：
速率理论及范弟姆特方程式对于研究影响高效液相色谱柱效的各种因素，同样具有指导意义：
由于组分在液体中的扩散系数很小，纵向扩散项（B/u）对色谱扩展的影响可以忽略不计，而传质阻力项（Cu）则成为影响柱效的主要因素，提高柱内填料装填的均匀性和减小粒度，以加快传质速率，可提高液相色谱的柱效能。目前常使用的固定相直径为5~10mμ。
液相色谱除了上述影响柱效的一些因素外，还应考虑到一些柱外展宽的因素。
三、实验用品
1．仪器
高效液相色谱（任一型号） 紫外光度检测器 恒流泵或恒压泵 溶剂过滤系统 高压六通进样阀 微量进样器（100μL） 超声波发生器 2．药品
苯、萘、联苯、甲醇（均为A.R） 纯水（去离子水，再经一次蒸馏）
标准贮备液 分别配制浓度为1000μg · mL的苯、萘、联苯的甲醇溶液。 标准工作液 将上述标准贮备液用甲醇稀释10倍，配成苯、萘、联苯的浓度分别为 100μg · mL的甲醇溶液。 混合样品 苯、萘、联苯
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四、操作步骤
1．测定条件的选择
（1）色谱柱长 250 mm，内径 4.6 mm，装填 C-18 烷基键合相，颗粒度 10μm 的固定相 （2）流动相 甲醇:水（83:17），流量 1.0 mL· min1
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（3）紫外光度检测器 测定波长 254 nm （4）进样量 20μL 2．仪器操作
（1）将配置好的流动相于超声波发生器上，脱气 15 min。
（2）将仪器按照仪器的操作步骤调节至进样状态，待仪器液路和电路系统达到平衡，基线平直时，吸取 60μL 标准工作液，进样 20μL，记录色谱图，重复进样两次。
（3）吸取 60μL 样品，进样 20μL，记录色谱图，重复进样两次。
五、数据处理
1．记录实验测定条件 （1）色谱柱与固定相 （2）流动相及其流量 （3）检测器 （4）进样量
2．测量各色谱图中苯、萘、联苯等的保留时间tR及相应色谱峰的半峰宽Y1/2，计算各对应理论塔板n，并将数据列表。已知组分的出峰顺序为苯、萘、联苯。 3．求样品中各组分的含量。
六、思考题
1．由计算得到的各组分理论塔板数说明了什么？
2．高效液相色谱采用 5~10 μm 粒度的固定相有何优点？为什么？
紫外分光光度法测定苯甲酸含量
一、实验目的
1. 了解紫外吸收光谱在有机化合物结构分析中的应用 2. 掌握测定试样测定波长的选择。 3. 学习有机物紫外吸收光谱定量分析。
二、实验原理：
本实验是基于分子中价电子吸收一定波长范围的紫外光而产生的分子吸收光谱，该光谱决定于分子的组成结构和分子中价电子的分布。在选定波长下，吸光度与物质的浓度符合朗伯比耳定律，利用此可进行定量分析。对具有兀键电子及共轭双键的化合物特别灵敏，其在紫外光区具有强烈地吸收，该法可用于有机化合物的纯度检查、未知样品的鉴定，分子结构的推测，互变异构体的判别和定量测定。
苯酚在227nm处有特征吸收峰，在一定范围内其吸收强度与苯甲酸的含量成正比，符合Lambert-Beer定律，因此，可用紫外分光光度法直接测定苯甲酸的含量。
三、仪器与试剂
1.仪器
1.1紫外分光光度计(7504型)；
1.2石英比色皿(1cm)：2个； 1.3容量瓶(100mL)：7只
1.4吸量管(1mL、2mL、5mL、10mL)：各1只。 2.试剂
2.1苯甲酸标准溶液(1mg/mL)； 2.2未知液：浓度约为50～55ug/mL。
四、实验操作
4.1 吸收池配套性检查
石英吸收池在220nm装蒸馏水，以一个吸收池为参比，调节τ为100%，测定另一吸收池的透射比，其偏差应小于0.5%，可配成一套使用，记录第二比色皿的吸光度值作为校正值。
4.2 吸收曲线的绘制
准确吸取未知液5mL，于100mL容量瓶中配成浓度约为10ug/mL的待测溶液，以蒸馏水为参比，于波长200～300nm范围内测定吸光度，作吸收曲线，从曲线上查得最大吸收波长（227nm附近）。吸收曲线如下图。
苯甲酸吸收曲线(10ug/mL)1.6001.4001.200吸光度1.0000.8000.6000.4000.2000.000200205210215220225230235240245250255260265270275280285290295300305310315320325330335340345350波长