取一个50 mL容量瓶（或比色管），用吸量管准确加入l.0 mL 100μg·mL铁标准溶液，1 mL盐酸羟胺溶液，摇匀。再加入2 mL Phen，5 mL NaAc溶液，以水稀释至刻度，摇匀。立刻用1 cm比色皿，以蒸馏水为参比溶液，在选定的波长（λmax）下测量吸光度。然后依次测量放置5 min，10 min，30 min，60 min，90 min，120 min后的吸光度。以时间t为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制A-t曲线。得出铁与邻二氮菲显色反应完全所需要的适宜时间。
2．铁含量的测定 （1）标准曲线的绘制 取6个50 mL容量瓶（或比色管），用吸量管分别加入0.0 mL，2.0 mL，4.0 mL，6.0 mL，
-1
8.0 mL，10.0 mL 10 μg·mL铁标准溶液， l mL盐酸羟胺溶液，摇匀。再加入2 mL Phen，5 mL NaAc溶液，摇匀。用水稀释至刻度，摇匀后放置10 min。用1 cm比色皿，以试剂空白为参比溶液（该显色体系的试剂空白为无色溶液，在条件试验中用蒸馏水作参比溶液，操作较为简单。），在所选择的波长（λmax）下，测量各溶液的吸光度。以含铁量为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制A-Fe含量标准曲线。
2+
在绘制的标准曲线上，查出某一铁浓度适中的标准溶液所对应的吸光度，计算Fe-Phen络合物的摩尔吸光系数ε。
（2）试样中铁含量的测定
准确吸取1.0 mL试液于50 mL容量瓶（或比色管）中，按上述标准曲线相同条件和步骤，测量其吸光度。从标准曲线上查出其相应的铁含量，然后计算出试液中铁的含量（单位
-1
为μg·mL）。
-1
五、思考题
1．从实验测得的吸光度求铁含量的依据是什么？如何求得？
2．试拟出一简单步骤，用吸光光度法测定水祥中的全铁（总铁）和亚铁的含量。 3．吸光光度法进行测量时，为何使用参比溶液，参比溶液选用的原则是什么？
实验七 亚硝酸盐含量的测定
（见课本）
一、目的与要求
1.学习肉制品中食品添加剂——亚硝酸盐的检测方法。 2.掌握盐酸萘乙二胺法的基本操作技术。 二、实验原理
样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合生成紫红色化合物，颜色的深浅与亚硝酸盐含量成正比，其最大吸收波长为538nm，可测定吸光度并与标准比较定量。
三、仪器与试剂 1.仪器
721型分光光度计；比色管、各种移液管及常用玻璃仪器；小型绞肉机。
2.试剂
（1）饱和硼砂溶液 溶解5g硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)于100mL热水中，冷却后备用。
（2）硫酸锌溶液 溶解30g硫酸锌(ZnSO4·7H2O)于100mL水中。 （3）对氨基苯磺酸溶液(0.4%) 溶解0. 4g对氨基苯磺酸于100mL 20%盐酸中，避光保存。
（4）盐酸萘乙二胺溶液(0.2%) 溶解0. 2g盐酸萘乙二胺于100mL水中，避光保存。
（5）亚硝酸钠标准溶液 精确称取0.1000g亚硝酸钠（硅胶干燥剂中干燥24h），加水溶解，移入500mL容量瓶，并稀释至刻度，混匀，临用前吸取5. 00mL于200mL容量瓶中，加水至刻度，混匀，此溶液每毫升相当5μg亚硝酸钠。
（6）材料午餐肉或腊肠。 四、测定步骤
1.样品中亚硝酸钠的提取
①称取2.50g经绞碎混匀的样品于50mL烧杯中，加硼砂饱和溶液6.3mL,搅拌均匀。
②以70℃左右的热水约150mL将样品全部洗入250mL容量瓶中，置沸水浴加热15min。
③取出冷却至室温，一面转动，一面滴加1.3mL硫酸锌溶液以沉淀蛋白质，
加水至刻度，混匀，放置30min。
④除去上层脂肪，用滤纸过滤，弃去最初20mL,滤液备用。 2.样品测定
①取6支25mL比色管，编号，按表6-11顺序加入各试剂及操作。 ②加水至25.00mL,混匀，静置15min，用2cm比色皿，以零号管调节零点，于波长538nm处测吸光度，记录。
③绘制标准曲线。以亚硝酸钠量(ug)为横坐标，与其对应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
④用样品提取滤液的吸光度，在以上亚硝酸钠标准曲线上查出亚硝酸钠的量(μg) 。
表6-11 加入试剂顺序及结果记录
管号
NaNO2标准溶液体积/mL 相当于NaNO2量/μg 样品提取滤液体积/mL 0.4%对氨基苯磺酸溶液体积/mL
0 0 0 1.00
1 0.20 1 1.00
2 0.40 2 1.00
3 0.60 3 1.00
4 0.80 4 1.00
5 20.00 1.00
混匀3~5min
0.2%盐酸萘乙二胺溶液体积/mL 吸光度
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
五、结果计算
A?1000 (6-13)
20m??1000250式中，X为样品中亚硝酸盐的含量，mg/kg;；A为测定用滤液中亚硝酸钠的 X=
含量，μg；m为样品的质量，g； 20/250为测定用样液体积(mL)/试样处理液总体积(mL) 。
六、注意事项
1.本法适用于肉制品中硝酸盐的测定。其方法是把沉淀蛋白质、除脂肪的溶液通过镉柱，使其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子，按此法测得总量B减去试样中亚硝酸盐含量C，即得试样中硝酸盐(以硝酸钠计)含量。
硝酸盐(以硝酸钠计)含量(g/kg) =(B-C)×l.232 (6-14)
式中，1.232为亚硝酸钠换算为硝酸钠的系数。
2.样品提取时，也可用亚铁氰化钾溶液2.5mL和乙酸锌溶液2.5mL代替1.3mL硫酸锌溶液，以沉淀蛋白质，配法如下。
（1）亚铁氰化钾溶液称取106g亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O],溶于水并稀释至1000mL。
（2）乙酸锌溶液称取220g乙酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O]，加30mL冰醋酸溶于水，并稀释至1000mL。
3.本法与国标方法大同小异，只是用实验室现有的25mL比色管，所有试剂相应减少。
4.当亚硝酸盐含量高时，过量的亚硝酸盐可以将偶氮化合物氧化变成黄色，而使红色消失，这时可以采取先加入试剂，然后滴加样液，从而避免亚硝酸盐过量。
七、思考题
1.本实验中参比溶液的作用?
2.为什么要对食物中亚硝酸盐的含量进行测定?
实验八 食品中水分活度值的测定——扩散法
（见课本）
1.目的与要求
①学习水分活度值测定的意义及实验原理。 ②掌握康威扩散法测定水分活度值的操作方法。 2.实验原理
样品在康威微量扩散皿的密封和恒温条件下，分别在Aw较高和较低的标准饱和溶液中扩散平衡后，根据样品质量的增加（在较高AW标准溶液中平衡）和减少（在AW较低标准溶液中平衡），以样品质量增减为纵坐标，各种标准饱和溶液Aw值为横坐标，绘出样品质量随溶液AW值变化的曲线，从而计算样品的水分活度值。
3.仪器与试剂 （1）仪器
①康威微量扩散皿。构造如图6-2所示。
②圆形小铝皿或玻璃皿。盛
放样品用，直径为25～28mm，深度为≤7mm。
③分析天平。感量0.0001g。
（2）标准试剂溶液配制标准试剂饱和溶液，其在25℃时的AW值如表6-2所示。
表6-2 标准水分活度试剂及其在25℃时的Aw值
试剂名称 重铬酸钾（K2Cr2O7·2H2O） 硝酸钾（KNO3） 氯化钡（BaCl2·2H2O） 氯化钾（KCl） 溴化钾（KBr） 氯化钠（NaCl） Aw 0.986 0.924 0.901 0.842 0.807 0.752 试剂名称 溴化钠（NaBr·2H2O） 硝酸镁[Mg(NO3)2·6H2O] 硝酸锂（LiNO3·3H2O） 碳酸钾（K2CO3·2H2O） 氯化镁（MgCl2·6H2O） 乙酸钾（KAc·H2O） Aw 0.577 0.528 0.476 0.427 0.330 0.224
图6-2 康威扩散皿
A— 内室；B—外室；C—玻璃盖；
D—铝皿或玻璃皿
硝酸钠（NaNO3） 氯化锶（SrCl2·6H2O） 0.737 0.708 氯化锂（LiCl·H2O） 氢氧化钠（NaOH·H2O） 0.110 0.070
4.实验步骤
①取4个康威皿，分别在每个康威皿的外室预先放入一种标准饱和试剂5mL，或标准的上述各式盐5.0g，加入少许蒸馏水湿润。在康威皿磨口边缘均匀地涂上一层凡士林，加盖密封。一般进行样品测定时，通常需选择2～4种标准饱和试剂，其中1～2份的标准饱和试剂Aw大于或小于试样的Aw值。 ②取4个已预先准确称重过的铝皿或玻璃皿，分别准确称取1.00g均匀样品，迅速放入各康威皿内室。把康威皿移至(25＋0.5) ℃温度条件下平衡(2＋0.5)h (绝大多数样品可在2h后测定AW值)。
③样品平衡完毕，取出铝皿或玻璃皿，用分析天平迅速称量。
④再次平衡0. 5h后，称量，直至恒重。分别计算各样品质量的增减值。
⑤实验数据记录（表6-3）。
表6-3 数据记录表
标准溶液或样品 样品质量增减 样品质量初读数/g 2h后样品质量/g 2.5h后样品质量/g 样品质量增减数/g
5.结果计算
以各种标准饱和溶液在25℃时的AW值为横坐标，对应的样品质量增减值为纵坐标，在坐标纸上描点作图，连接各样品质量增减值点成一直线，此线与横坐标轴的交点即为该样品的水分活度值。
水分活度值计算实例:某食品样品在硝酸钾标准饱和溶液中增重7mg，为A点;在氯化钡标准饱和溶液中增重3mg，为B点；在氯化钾标准
图6-3 Aw值测定图解