论文第50卷第24期 2005年12月
一个新的水稻卷叶突变体rl9(t的遗传分析和基因定位 严长杰*严松*张正球梁国华陆驹飞顾铭洪?
(扬州大学江苏省植物功能基因组学重点实验室, 江苏省作物遗传生理重点实验室, 扬州 225009.
* 同等贡献. ? 联系人, E-mail: yichuan@yzu.edu.cn
摘要对水稻中调控形态发育的基因进行发掘和研究是进行水稻株型改良和植物生长发育分子生物学研究的重要基础研究工作. 本研究在粳稻中花11中鉴别了一个新的卷叶突变体, 并对其进行了遗传分析和基因定位. 结果表明, 该卷叶突变体是由一隐性单位点(rl9(t控制, 利用SSR标记已经把Rl9(t定位在水稻第9染色体上. 利用已经公布的水稻基因组序列, 在Rl9(t附近区域发展了30个新的STS标记, 对Rl9(t进行了精细定位. 以此为基础, 构建了覆盖Rl9(t区域的PAC重叠群, 并把目标基因定位在一个约
42 kb 的区段上, 为最终克隆目标基因奠定了基础. 关键词水稻(Oryza sativa L卷叶基因分子标记物理图谱
水稻叶片是光合作用的重要场所, 也是株型构成的重要因素. 在高产育种及株型改良中, 叶片性状一直是水稻遗传育种家关注的焦点[1]. 研究表明, 叶片适度卷曲有利于保持叶片直立, 改善水稻生长中后期群体基部的受光条件, 提高光能利用效率, 从而有利于水稻产量的提高[2~6].
水稻是一多型性作物, 存在丰富的品种类型, 叶片的变异也极其多样. 从卷曲方向看, 有正卷的(叶片两侧沿中脉向内卷曲, 也有反卷的(叶片两侧沿中脉向外卷曲;
从同一植株不同叶位看, 有全株叶片卷曲, 也有部分叶片卷曲的; 从卷曲程度看, 有高度卷曲成筒状的, 也有中度卷曲和微卷的. 因此利用不同的卷叶材料, 分析控制叶片生长发育的基因及其分子调控机理, 对研究植物叶片发育的分子生物学具有重要的理论意义.
尽管水稻中卷叶材料比较丰富, 但对其遗传和分子生物学研究却比较缺乏. 迄今, 在Gramene网站上公布了6个控制卷叶的隐性基因rl1, rl2, rl3, rl4, rl5和rl6, 分别标定在经典遗传图的第1, 4, 12, 1, 3和7染色体上. 另外, 李仕贵等人[7]和邵元健等人[8]分别在第5染色体的RG13-RG57和RM6954-RM6841区间内定位到一个隐性卷叶基因(rl7和rl8, 顾兴友等人[9]在日本流岗卷叶粳中发现一个不完全显性方式遗传的卷叶基因Rl(t. 除rl7和rl8外, 其余卷叶基因均未在分子图谱上定位. 我们利用60Co-γ射线辐射水稻品种中花11, 获得了一个卷叶突变体, 其主要特征为叶片高度卷曲成筒状, 结实率低, 籽粒小而畸形. 对该突变体初步的遗传分析表明, 该突变体的卷叶性状为单个隐性基因控制. 根据该突变体的表型特征和基因所在染色体的位置, 推断本研究中的卷叶基因是一个新卷叶基因, 将其命名为rl9(t.
本研究应用已经公布的SSR(simple sequence re-peat标记和根据已经测定的水稻基因组序列发展STS标记对Rl9(t基因进行精细定位.
1材料与方法
(ⅰ 供试材料. 本研究以60Co-γ射线辐照粳稻水稻品种中花11的干种子, 在M2代得到卷叶突变体(rl9(t, 经过连续多代自交种植, 确认该突变体性状能稳定遗传; 平展叶材料包括野生型品种中花11(粳稻, 籼稻品种Dular和南京11(N11.
(ⅱ 叶片的细胞结构观察. 在5~7叶龄期分别取rl9(t突变体和正常植株的新鲜叶片, 直接作徒手切片, 在Leica DMRXA显微镜下观察拍照.
(ⅲ F2遗传群体的构建. 2003年夏在扬州大学农学院试验农场以rl9(t突变体为母本分别与中花11, Dular和N11杂交, 同年于海南种植F1, 2004夏在扬州种植亲本,
F1和F2群体, 单本栽插. 田间管理同一般大田. 2005年春在海南扩大种植F2(rl9(t突变体/Dular群体. 抽穗后对各分离群体中植株叶片和穗部性状进行调查.
(ⅳ 初步定位. rl9(t突变体与Dular杂交的F2代所得的169株卷叶单株组成定位群体, 分别提取每个单株的基因组DNA, 水稻基因组DNA的提取采取CTAB法[10]. 以BSA法[11]建成卷叶池和非卷叶池(各15株DNA等量混合, 利用微卫星标记对分离群体的2个亲本进行多态性分析, 并进一步利用多态标记分
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析两池间的多态性, 找出可能与卷叶基因连锁的标记, 然后用找出的连锁标记对F2群体中各卷叶单株进行分析. SSR分析中所用到的引物序列引自http:// www.gramene.org/. 引物由上海生工公司合成, 25 μL 反应体系中包括10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3, 50 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl2, 1 U Taq酶, 4 nmol/L dNTP, 10 pmol/L引物, 20 ng模板DNA. 在Biometra PCR仪上进行PCR 扩增, 反应条件为: 94℃预变性5 min; 94℃, 1 min, 55℃, 1 min, 72℃, 1.5 min, 33个循环; 72℃延伸10 min. 反应产物首先在3%琼脂糖凝胶上电泳, 经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察, 并在BIORAD凝胶成像仪上成像. 如果在3%琼脂糖凝胶上电泳没有多态, 则在6%垂直平板聚丙烯酰胺凝胶上电泳, 经0.1%硝酸银染色后观测.
(ⅴ 精细定位. 根据初步定位的结果和已公布的水稻品种93-11和日本晴全基因组序列, 利用Primer Premier 5.0软件, 在目标基因所在染色体区域的PAC克隆上设计STS标记进行精细定位. 引物合成, PCR反应和电泳分析条件同上.
(ⅵ 遗传作图. 根据SSR分析的结果, 用MAPMAKER3.0[12]软件进行连锁分析, 利用Kosambi 函数将重组率转化为遗传距离(centiMorgan, cM.
2结果与分析
2.1 卷叶突变体的表型特征