【复习目标】

本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。 【复习重点与难点】

复习重点：凝胶色谱法的原理和方法。 复习难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。 【知识回顾】： 一、实验原理

蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。 1．凝胶色谱法（分配色谱法）：

（1）原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 [来源: ]

（3）分离过程：

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

＊ 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 （4）作用： 分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。

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2．缓冲溶液

（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H23－3，－，，调节酸和盐的用量，可配制不同的缓冲液。 2424等）

（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液的干扰而保持稳定。 3．凝胶电泳法：

（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 （3）分离过程：在一定下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的，形成“蛋白质－复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 二、实验步骤 1．样品处理 ① 红细胞的洗涤

洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。

②血红蛋白的释放

在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。 注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。 2．粗分离

①分离血红蛋白溶液

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将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

②透析

取1的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300的物质的量的浓度为20的磷酸缓冲液中，透析12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。 3．纯化

调节缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的

缓冲液缓慢下降到与凝

↓ 胶面平齐，关闭出口。

加入蛋白质样品：用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到

色谱柱的顶端。加样后，

∣ 打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样

品完全渗入凝胶层后，

↓ 关闭出口。

调节缓冲液面：加入20的磷酸缓冲液到适当高度

↓

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