CRISPR Activation Plasmid Transfection Protocol

第1阶段：CRISPR激活质粒瞬时转染

这个协议是为6孔培养板的单个孔推荐的。根据不同大小的孔或培养皿按比例调整细胞和试剂的用量。

? 转染前24h，在6孔培养板每孔用3ml无抗生素的标准生长培养基培养1.5×105 - 2.0

×105个细胞。使细胞40-80％融合。24h后初始细胞接种和细胞融合由转染细胞的细胞生长的速率来确定。成功激活CRISPR质粒转染要求健康的、融合的细胞 ? 准备以下溶液：

注：最佳的质粒DNA：应确定UltraCruz?转染试剂的比例与质粒DNA的1ug和5-15ul UltraCruz?转染试剂的实验之间开始。一旦转染试剂量被优化以最小化细胞毒性，质粒DNA的浓度可以在每孔1-3ug之间变化。如果最佳UltraCruz?转染试剂体积为10ul，然后从1-3ug/10ul质粒DNA的浓度进行测试。例如，测试质粒DNA/ UltraCruz?Transfection试剂量：1ug/10ul，2ug/10ul，和3ug/10ul。每孔应当用质粒DNA/ UltraCruz?转染试剂复合物的适当的量进行测试，以确定哪些量可以提供最高水平的转染效率。

溶液A：对于每个转染，稀释1-3ug质粒DNA入质粒转染培养基：SC-108062，至终体积为150ul。移液器上下混合。在室温下静置5min。

溶液B：对于每个转染，用足够的质粒转染培养基：SC-108062稀释5-15ul UltraCruz的转染试剂：SC-395739使终体积为150ul。移液器上下混合。在室温下静置5min。 注意：不要将抗生素添加到质粒转染培养基：SC-108062。

? 使用移液管向稀释的UltraCruz?转染试剂（溶液B）直接滴加质粒DNA溶液。立即涡

旋混匀并在室温下孵育不不少于20min。 ? 在转染前，用新鲜的无抗生素的生长培养基替换培养基。将300ul质粒DNA/ UltraCruz?

转染试剂复合物（溶液A+溶液B）滴加到6孔培养板。 ? 轻轻旋动板混合。

? 在常用培养条件下孵育细胞24-72h。在转染后的前24h没有必要更换培养基。转染后

24-72h根据需要添加或更换培养基。

? 对于用CRISPR Activation Plasmid转染的细胞，转染后48-72h测定细胞。 第2阶段：细胞测定 ? 对于蛋白质分析，细胞裂解前3天把培养基换成标准生长培养基。为了裂解贴壁细胞，

吸掉培养基，用PBS清洗细胞，刮掉细胞并以低速离心以获得细胞沉淀。对于悬浮细胞，将培养液转移到一个离心管中，低速离心细胞以获得细胞沉淀。用PBS清洗并再次离心。对于100％的融合HEK 293或HeLa细胞，向沉淀加入100μlRIPA Lysis Buffer System: sc-24948。对于其它细胞系或融合情况，RIPA Lysis Buffer System的使用量应通过实验来确定。超声处理或剪切细胞。在冰上孵育样品10min，涡旋，再在冰上孵育10min。10000r/20min/4°C.旋转细胞裂解物，使用BCA Protein AssayKit: sc-202389确定蛋白质浓度。

? 用P.Chomczynski 和 N. Sacchi描述的RT-PCR方法分析分离RNA。通过RNA分离

的单步方法酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿萃取。Anal. Biochem.162: 156-159)或市售的RNA分离试剂盒。