PCR技术的发展及应用

平骏 14112822276

摘要：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是1985年由美国PE- Cetus 公司的科学家

Kary Banks Mullis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。经历了近30年的技术发展，现如今PCR技术在生命科学研究以及相关的很多领域都得到广泛的应用。本文主要对PCR的基本原理、反应组份作简要的介绍；同时也对在PCR基础上发展起来的相关技术作简要综述。 关键词：PCR技术；PCR原理；PCR新技术

对核酸的研究己有100多年的历史，20世纪70年代初人们就致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想，该设想在1985年被Mullis等人实现，他们发明了具有划时代意义的聚合酶链反应[6]。这项新技术是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的特点，实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增，可在短时间内从试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。PCR技术操作简便、结果可靠，被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学等各个领域的基因研究和分析，对分子生物学的发展产生了深远的影响[18]。发明人Kary Banks Mulis也因此荣获了1994年的诺贝尔化学奖。

1、PCR 技术的原理[1,2]

PCR技术是模拟细胞内DNA的天然复制过程，DNA 聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链 DNA 来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下， DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3- OH 末端，并以此为起始点，沿模板5→3方向延伸，合成一条新的 DNA互补链。简言之，其基本原理包括3个基本反应过程：变性→退火→延伸。PCR 反应的基本成分包括：模板DNA( 待扩增DNA )、引物、4种脱氧核苷酸( dNTPs)、DNA 聚合酶和适宜的缓冲液。每一循环中所合成的新链，又都可作为下一循环中的模板。PCR 合成的特定的DNA序列产量随着循环次数呈指数增加，每完成一次循环需2-4min，2-3h就能将目的基因扩增，从而达到迅速大量扩增的目的。

，

，

，

2、PCR技术的反应组份

2.1 模板DNA

PCR反应的模板可以是单链DNA也可以是双链 DNA，可以是基因组DNA 或 cDNA，

mRNA 也能作为PCR的模板，只需用逆转录酶把 mRNA 逆转录为cDNA即可。模板量的多少及其纯度的高低，是PCR成败与否的关键因素之一[6]。由于PCR反应的特异性由寡聚核苷酸引物决定, 模板DNA不需要高度纯化，但应避免任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、能结合DNA的蛋白质及多糖类物质的污染[18]。PCR所需模板DNA的量极微(通常在纳克级范围内)，通常适宜的模板DNA浓度为30-50ng，不到1纳克的基因组DNA序列就足以用来进行PCR分析，甚至用1个DNA分子就能扩增出特定的DNA 序列。

A-变性；B-退火；C-延伸

图1 PCR原理（摘自 邓小红等, 2007）

2.2 引物

引物是PCR特异性反应的关键，PCR引物是一段与待扩增DNA序列互补的寡核苷酸片段，长度大多为 10-30个碱基。一般情况下，一对引物包含5端与正义链互补的寡核苷酸片段和3端与反义链互补的寡核苷酸片段，这两个寡核苷酸片段在模板 DNA 上的结合位置之间的距离决定 PCR 扩增片段的长度。PCR 反应成功的关键是设计最佳的引物。引物设计的先决条件是与引物结合的靶 DNA 序列必须是已知的，设计引物时尽可能的选择碱基随机分布的序列，尽量避免多嘌呤、多聚嘧啶或其他异常序列。避免引物自身形成发夹结构等二级结构，尤其是两个引物之间不应存在互补序列，尤其是在引物的3末端，即使无法避免，其3端的互补碱基也不能多于2个，以减少“引物二聚体”的形成。否则会影

，

，

，

，

响靶DNA序列的扩增。在合成新链时，DNA聚合酶将单核苷酸添加到引物的3末端，因此引物3端的5- 6 个碱基与靶 DNA 片段的配对必须精确、严格。两个引物中G+ C碱基对的百分比( G+ C%)应尽量相似，若待扩增序列中GC 含量已知时，引物的 GC 含量则应与其类似。一般情况下，设计引物时，G+ C 碱基对含量以40% - 60%为佳，解链温度 ( melting temperature,Tm) 应高于55℃。 2.3 DNA聚合酶

最初的DNA聚合酶是从大肠杆菌中提取得到的DNA聚合酶I的Klenow片段。该片段具有DNA聚合酶活性和3-5的外切核酸酶活性，能识别和消除错配的引物末端，以校正复制过程中错配的核苷酸。但是它有一个缺点，即Klenow 片段对热很敏感，DNA的变性温度就可以使酶失去活性，因此在PCR的变性步骤之后都必须重新添加聚合酶，否则实验无法继续进行，这样增加了PCR操作的繁琐程度，而且反应效率低，成本增加。后来，在美国黄石国家公园的温泉中发现了嗜热菌-水生栖热菌(Thermus aquatics, Taq)，从中分离提取出了一种DNA聚合酶。由于这些聚合酶具有95℃以上的耐热性，只要在PCR反应开始时加一次聚合酶，就能在整个PCR循环中保持酶活性，大大简化了PCR操作程序，提高了PCR扩增效率，从而使PCR 技术得到了进一步完善。目前，Taq DNA 聚合酶在PCR反应中广为应用。 2.4 dNTPs

dNTPs ( dATP、dCTP、dGTP和dTTP ) 是PCR反应中靶DNA序列扩增的原料。dNT P在温度较高时容易失活，因此需要在- 20 ℃下冰冻保存，以保证 dNTP的质量。在PCR 反应中，dNTP浓度以50-200μmol/L为宜，但是也不能低于10- 15μmol/L。dNTP浓度过高易引起非特异性PCR产物，还会抑制Taq 酶的活性；浓度过低则会影响扩增产量。尤其重要的是4种dNTP的体积浓度要相等，否则就会引起错配。 2.5 M g缓冲液

PCR反应的标准缓冲液通常含有10mmol/L Tri-s HCl (pH8.3)，50mmol/L KCl和1.5mmol/ L MgCl2。PCR反应体系中Mg2+的浓度非常的重要，当各种dNTP浓度为200μmol/L时，M g2+浓度为1. 5-2. 0mmol/L时为宜。当M g2 +浓度过高时，会使反应特异性降低，出现非特异扩增；当浓度过低时会使Taq DNA聚合酶的活性降低，使反应产物减少。同时，Mg2+的有效浓度受到高浓度的螯合剂、高浓度的带负电荷离子基团的影响，比如EDT A、磷酸根等。它们可与Mg2+结合从而降低Mg2+的有效浓度。因此，每当首次使用靶序列、引物、dNTP(含磷酸根)的新组合时，都要将Mg2+浓度调至最佳。通常的方法是设置一组反应实验，每一反

2+

，

，

，

，