第二章 细胞生物学研究方法

第一节 显微技术

显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源。

—、光学显微镜

（一）、普通光学显微镜

普通生物显微镜由3部分构成，即：①照明系统，包括光源和聚光器；②光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成；③机械装置，用于固定材料和观察方便（图2-1）。

图2-1 尼康E-600显微镜

显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关，分辨力是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨物体最小间隔的能力，分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率，用公式表示为：

R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsinα/2

式中：n=介质折射率；α=镜口角（标本对物镜镜口的张角），N.A.=镜口率（numeric aperture）。镜口角总是要小于180?，所以sina/2的最大值必然小于1。

表2-1 及中介质的折射率

介质 折射率 空气 1 水 1.33 香柏油 1.515 α溴萘 1.66 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。

普通光线的波长为400~700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。 （二）、荧光显微镜

图2-2 尼康E800荧光DIC显微镜

细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜（图2-2，3，4）就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。

图2-3 落射式照明原理

荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：

1. 照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上（图2-3）； 2. 光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；

3. 有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。

图2-4 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色），图片来自http://www.itg.uiuc.edu