实验报告

一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得

二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析

一、实验目的和要求

1、学习离子交换层析的基本原理

2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法

二、实验内容和原理

1、离子交换层析

由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。 2、酶活力检测

蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。（50℃水解） 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。（100℃显色）

三、实验材料和主要仪器

1、实验材料

蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品Ⅲ） 2、实验试剂

⑴ DEAE-Sepharose Fast Flow

⑵ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液

⑶ 20mmol/L Tris-HCl（1mol/L NaCl）pH7.3缓冲液 ⑷ 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5 ⑸ 5%蔗糖溶液

⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂 3、实验仪器

（1）高速冷冻离心机

（2）层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组）

（3）?KTATM start（1套/组）

（4）部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组） （5）－20℃冰箱（保存样品用） （6）微量移液枪 200ul、1000ul

（7）1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用） （8）7ml离心管（留样品Ⅳ用） （9）恒温水浴（50℃、100℃） （10）试管、移液管、试管架等

四、实验方法和步骤

1、仪器连接

（1）接通各仪器电源，将A,B泵头分别放置A，B两个溶液瓶中。注意B为含NaCl溶液。 （2） 点击电脑桌面上Unicorn软件图标，打开软件。选择System Control ，点击OK，进入操作界面。点击Connect

（3） 在操作界面的工具栏，点击Mannual Run。出现FlowRate 窗口，调节flowrate为 1ml/min，确定。 2、装柱与平衡

（1）检查层析柱的两端接头，底端有膜的置于下方。

（2）程序暂停。将层析柱放入卡槽，上端接头与混合器（Mixer)相连，下端接头与样品阀（Sample valve)相连。

（3）BufferA平衡一个柱体积（约20ml=20min） 3、加样

停止加入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。待缓冲液液面与胶体表面相切时，程序暂停pause。旋开柱上方接头，用胶头滴管缓慢将5ml蔗糖酶蛋白样品溶液（样品Ⅲ）加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。程序继续continue，使样品溶液进入胶体，待样品溶液完全进入胶体后，程序暂停pause，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下，并完全进入胶体后，再加缓冲液至一定高度。 4、洗脱（梯度洗脱法）

（1）加样后，先用BufferA进行洗脱，洗去未被凝胶吸附的杂蛋白（20min左右）； （2）待层析柱流出液在仪器上绘出的基线稳定，在程序主界面的工具栏 Manual → Execute manual instruction → pumps → Gradient，在两个框内均填入100，点击insert，最后点击一次execute，开始梯度洗脱。每2min接一管，当Conductivity上升至8 mS/cm 时，开始测定各管的蔗糖酶活力；

（3）将蔗糖酶活力高的若干管酶液（2-3管）合并，测量总体积V4（样品Ⅳ），样品用7ml离心管－20℃保存。 5、蔗糖酶活力检测

五、实验数据记录和处理

上次实验粗提取的蔗糖酶蛋白溶液V3=12.3ml 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5 5%蔗糖溶液 蒸馏水 部分收集的酶液 3.5－二硝基水杨酸试剂(DNS) 蒸馏水 观察颜色 本次实验加样的蔗糖酶蛋白溶液V3’=5.0ml 蔗糖酶活力高的两管酶液合并后V4=4.0ml

空白对照（1） 0.5ml 0.5ml 1.0ml / 50℃水浴5min 0.5ml 100℃水浴2min 3.0ml 3.0ml 0.5ml 样品管（n） 0.5ml 0.5ml 0.95ml 0.05ml 六、实验结果和分析

1、洗脱曲线

（1） UV曲线

① 在55-70min时，UV曲线有两个峰值，这是未被凝胶吸附的杂蛋白的体现。 ② 85-95min的峰值性状较为“规准”，但经过活性检测发现为杂蛋白。

③ 105-120min有一个峰值较小的峰，经过活性检测其中含有活性较高的蔗糖酶。

实验名称：__离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶____姓名： 吴逸璇 学号： 3170100207

（2） 在73min左右，BufferValve B的值瞬间上升，这是由于操作失误导致的。当时直接把

Buffer valve的阀门由A转换到B，而没有一个梯度的上升。但好在及时止损，开始了正确的操作。 正确操作：“在程序主界面的工具栏 Manual → Execute manual instruction → pumps