实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化

【实验目的】

熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。 【实验原理】

当大肠杆菌生长到OD600约为0.2~0.4时，用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞，细胞膨胀成球形，可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态（感受态），处于此状态的细胞称为感受态细胞（competent cells）。此时，若在感受态细胞中加入质粒，则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面，经过42℃短暂的热激处理后，DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞，在不含抗生素的培养基中短暂培养，使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达，在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌（含质粒）与未转化细菌分开，转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落，而未转化的细菌则不能。 【器材与试剂】

1．实验仪器 培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22μm滤膜），酒精灯

2．实验试剂 氯化钠（AR），无水氯化钙（AR），蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g， 800 mL蒸馏水溶解后，用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min； LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g， 800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121℃高压灭菌20min，分别倒入无菌培养皿。若配制选择性培养基，当温度降至60℃左右时，加入1 mL氨苄青霉素溶液（100mg/mL），混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯化钙11.1 g，用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min，4℃保存；氨苄青霉素钠溶液：准确称取氨苄青霉素钠0.5 g，用蒸馏水溶解并定容至5 mL，用微孔滤器过滤除菌后，分装于Eppendorf管中，-20℃保存。 3.实验材料 E.coli DH5α, pUC18质粒 【实验步骤】

1．接种大肠杆菌单菌落于2 mL LB液体培养基中，37℃振荡（约250r/min）培养过夜。 2. 将2 mL过夜培养物转接到盛有100 mL的LB液体培养基的500 mL三角瓶中，37℃继续振荡培养至OD600约为0.2~0.4（约2 h）。

3．取1 mL培养物于一灭菌的Eppendorf 管中，冰浴放置10～30 min，4℃，1 500×g离心5 min，弃上清。

4．沉淀用0.2 mL冰冷氯化钙溶液轻轻悬浮，冰浴放置15 min，4℃，1 500×g离心5 min，弃上清。

5．沉淀再用0.2 mL氯化钙溶液轻轻悬浮，放置在冰浴中，制成大肠杆菌感受态细胞。 6. 取5 μL pUC18质粒(不超过10 ng)，加入制好的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min。 7. 42 ℃热激90 s后，迅速置于冰浴5 min。

8. 加入800 μL培养基，37 ℃振荡（100 r/min）温育1 h，使pUC18上的氨苄青霉素抗性基因得以表达。

9. 取200 μL涂布于含氨苄青霉素钠 (100 μg/mL)的LB固体培养基上, 正向放入37℃培养箱中培养1 h，再倒置培养过夜至菌落清晰，统计菌落数量。 【注意事项】

1． 应使用处于对数生长期的大肠杆菌细胞，OD600最好不超过0.4。 2． 整个实验最好在低温环境下进行，以获得较高的转化效率。 3． 每次悬浮沉淀细胞要轻缓，避免剧烈振荡。 【实验作业】

根据质粒的用量，计算本实验制备感受态的转化率（cfu/μg DNA）。

参考文献

1． 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社，1993. 287~289 2． 刘进元等. 分子生物学实验指导. 北京：清华大学出版社，2002. 22~25

3． Cohen SN, Chang ACY, Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: Genetic

transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1972,69:2110 4. 魏群.分子生物学实验指导.北京：高等教育出版社，1999.53～55

实验二 质粒的提取与琼脂糖凝胶电泳分析

【实验目的】

熟悉碱法提取质粒以及DNA的琼脂糖电泳分析的原理和方法。 【实验原理】

在碱性条件下，染色体DNA发生变性，共价闭合的质粒DNA仍为自然状态。当溶液调至中性且有高浓度的盐存在条件下，变性的染色体DNA交联成不溶性的网格结构，变性的染色体DNA与蛋白质发生共沉淀，而质粒DNA仍存在于上清液中，通过离心去除沉淀，溶液中的质粒DNA可被异丙醇沉淀。

DNA在碱性的电泳缓冲溶液中因带负电荷，电泳时向正极移动，不同DNA的电泳迁移率与其分子长度与形态有关，DNA分子越大，则迁移率越小，因此，通过电泳可将不同长度的DNA分子分开。 【器材与试剂】

1．实验仪器 细菌培养箱，控温摇床，高压灭菌锅，微量移液器，高速台式离心机，电泳仪，水平电泳槽，紫外分析仪，pH计，微波炉

2．实验试剂 琼脂粉，100 mg/mL 氨苄青霉素钠，氯仿，异丙醇，70% 乙醇，琼脂糖，溴化乙锭，20 μg/mL RNase A， LB液体培养基，溶液I：50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA, 25 mmol/L Tris-Cl缓冲溶液（pH8.0）；溶液II：0.2 mol/L NaOH，1% SDS；溶液III: 3 mol/L 醋酸钾，5 mol/L 醋酸；TE缓冲溶液：10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0),1 mmol/L EDTA；TAE缓冲溶液（50×）：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA,pH8.0；载样缓冲溶液（10×）：0.25% 溴酚蓝，30%甘油。

3．实验材料 转化pUC18的大肠杆菌（E.coli DH5α），λDNA/EcoR I, Hind III 【实验步骤】 一、质粒的提取

1．从平板上挑取转化pUC18的大肠杆菌的单菌落，接种于20 mL 含100 μg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，37℃，振荡（250 r/min）培养过夜。

2．取1.2 mL培养物置于Eppendorf管中，10 000 rpm离心1min，弃上清。

3．沉淀菌体用0.1 mL溶液I重新悬浮，加入0.2 mL溶液II，颠倒数次至溶液变得澄清，最后加入0.15 mL溶液III，轻轻颠倒Eppendorf管数次，10 000 rpm离心10 min。

4．上清液移入一个新的Eppendorf管中，加入0.2 mL氯仿，快速颠倒数次，10 000 rpm离心10 min，将上清液移入另一个Eppendorf管中，加入等体积异丙醇，混匀，10 000 rpm离

心10 min，弃上清。

5．向管中加入0.5 mL 70%乙醇，10 000 rpm，离心2 min，弃上清，室温挥干酒精，加入20 μL 含20 μg/mL RNase A 的TE缓冲溶液溶解DNA。 二、琼脂糖凝胶电泳

1．称取1 g 琼脂糖，加入TAE缓冲溶液（1×）100 mL，微波炉加热熔化，配制 1%琼脂糖凝胶，稍微冷却后，倒入制胶模具，插好梳子，待胶凝固后，拔出梳子。

2．将凝胶连同制胶模具放入电泳槽，倒入TAE缓冲溶液（1×）使溶液没过胶面，取9 μL提取的质粒与1 μL栽样缓冲溶液混合，用微量移液器点加到凝胶的加样孔内。 3．80～100 V 电泳，当溴酚蓝移动到距凝胶下边沿约1cm处时，停止电泳。

4．将凝胶浸泡在含0.5 μg/mL溴化乙锭的TAE缓冲溶液（1×）中染色30 min，于紫外分析仪内观察结果。 【注意事项】

1． 质粒提取过程中，加入溶液II和溶液III后，要混匀，但动作要轻缓。 2． 质粒沉淀后，由于量比较少，贴在管壁上，在洗涤时不要将其移走。 【实验作业】

1． 说明溶液I、溶液II和溶液III的作用是什么？ 2． 在琼脂糖凝胶上，哪一条带为超螺旋DNA？为什么？

参考文献

1． 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社，1993. 107~108 2．刘进元等. 分子生物学实验指导. 北京：清华大学出版社，2002. 1~10

实验三 重组DNA分子的构建

【实验目的】

熟悉DNA的酶切、片段回收、DNA连接、转化以及重组子的筛选的方法。 【实验原理】

DNA经限制性内切酶切割成大小不同的片段，电泳分离后，切胶回收目的片段，琼脂糖凝胶用高浓度的NaI溶液溶解后，玻璃奶（glass milk）可以吸附DNA，去除NaI后，用无菌水或TE缓冲溶液解吸附，获得DNA片段。回收的酶切质粒DNA与目的DNA片段，在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，构建重组子，重组子转化大肠杆菌后，提取重组DNA分子进行酶切鉴定或利用其它方法如α-互补进行筛选。 【器材与试剂】

1．实验仪器 细菌培养箱，恒温摇床，超净工作台，台式离心机，水浴锅，高压灭菌锅，微量移液器，电泳仪，电泳槽，紫外分析仪

2．实验试剂 氯化钠（AR），蛋白胨，酵母提取物，氨苄青霉素钠，EcoR I, Hind III, 酶切缓冲液（买酶附赠），琼脂糖，TAE缓冲溶液（50×），玻璃奶（glass milk）， NaI溶液（溶胶液）： 称取NaI 90.8 g, Na2SO3 1.5 g，用无菌水溶解并定容至100 mL，4℃，避光保存；乙醇洗涤液：50 mL乙醇中含 20 mmol/L Tris-Cl (pH7.4), 1 mmol/L EDTA，0.1 mol/L NaCl, -20℃保存；灭菌双蒸水，T4 DNA连接酶，T4 DNA连接酶缓冲液（购酶附赠），载样缓冲溶液（10×），X-gal溶液：20 mg 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal） 溶于1 mL二甲基甲酰胺中；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）溶液：1 g IPTG 溶于4 mL双蒸水，定容至5 mL，微孔滤器除菌，-20℃保存

3．实验材料 E.coli DH5α, pUC18质粒，λDNA/EcoR I, Hind III 【实验步骤】 一、DNA的酶切

20 μL酶切体系含：2 μL 酶切缓冲液，5 μL pUC18质粒（ 约2μg），1 μL EcoR I ，1 μL Hind III, 11 μL 无菌双蒸水。离心5 s, 混匀，37℃酶切30 min～1 h。 二、电泳分离

1． 配制1%的琼脂糖凝胶，方法同前一实验。

2. 20 μLλDNA/EcoR I, Hind III（约2 μg）和酶切体系中分别加入2 μL载样缓冲溶液（10×），混匀，分别加样，电泳，具体方法如前一实验。 2． 将凝胶在溴化乙锭染色液中染色30 min。