分子生物学常规实验方法 下载本文

实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化

【实验目的】

熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。 【实验原理】

当大肠杆菌生长到OD600约为0.2~0.4时,用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞,细胞膨胀成球形,可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态(感受态),处于此状态的细胞称为感受态细胞(competent cells)。此时,若在感受态细胞中加入质粒,则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面,经过42℃短暂的热激处理后,DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞,在不含抗生素的培养基中短暂培养,使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达,在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌(含质粒)与未转化细菌分开,转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落,而未转化的细菌则不能。 【器材与试剂】

1.实验仪器 培养箱,恒温摇床,超净工作台,低温台式离心机,分光光度计,水浴锅,高压灭菌锅,微孔滤器(含0.22μm滤膜),酒精灯

2.实验试剂 氯化钠(AR),无水氯化钙(AR),蛋白胨,酵母提取物,1.0 mol/L NaOH,氨苄青霉素钠,琼脂粉,LB液体培养基:蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g, 800 mL蒸馏水溶解后,用NaOH溶液调pH至7.0,蒸馏水定容至1 000 mL,121℃高压灭菌20 min; LB固体培养基:蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g, 800 mL蒸馏水溶解后,用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0,蒸馏水定容至1 000 mL,然后加入琼脂粉15 g,121℃高压灭菌20min,分别倒入无菌培养皿。若配制选择性培养基,当温度降至60℃左右时,加入1 mL氨苄青霉素溶液(100mg/mL),混匀,分别倒入无菌培养皿;CaCl2溶液:准确称取无水氯化钙11.1 g,用双蒸水溶解,并定容至1 000 mL,121℃高压灭菌20 min,4℃保存;氨苄青霉素钠溶液:准确称取氨苄青霉素钠0.5 g,用蒸馏水溶解并定容至5 mL,用微孔滤器过滤除菌后,分装于Eppendorf管中,-20℃保存。 3.实验材料 E.coli DH5α, pUC18质粒 【实验步骤】

1.接种大肠杆菌单菌落于2 mL LB液体培养基中,37℃振荡(约250r/min)培养过夜。 2. 将2 mL过夜培养物转接到盛有100 mL的LB液体培养基的500 mL三角瓶中,37℃继续振荡培养至OD600约为0.2~0.4(约2 h)。

3.取1 mL培养物于一灭菌的Eppendorf 管中,冰浴放置10~30 min,4℃,1 500×g离心5 min,弃上清。

4.沉淀用0.2 mL冰冷氯化钙溶液轻轻悬浮,冰浴放置15 min,4℃,1 500×g离心5 min,弃上清。

5.沉淀再用0.2 mL氯化钙溶液轻轻悬浮,放置在冰浴中,制成大肠杆菌感受态细胞。 6. 取5 μL pUC18质粒(不超过10 ng),加入制好的感受态细胞中,轻轻混匀,冰浴30 min。 7. 42 ℃热激90 s后,迅速置于冰浴5 min。

8. 加入800 μL培养基,37 ℃振荡(100 r/min)温育1 h,使pUC18上的氨苄青霉素抗性基因得以表达。

9. 取200 μL涂布于含氨苄青霉素钠 (100 μg/mL)的LB固体培养基上, 正向放入37℃培养箱中培养1 h,再倒置培养过夜至菌落清晰,统计菌落数量。 【注意事项】

1. 应使用处于对数生长期的大肠杆菌细胞,OD600最好不超过0.4。 2. 整个实验最好在低温环境下进行,以获得较高的转化效率。 3. 每次悬浮沉淀细胞要轻缓,避免剧烈振荡。 【实验作业】

根据质粒的用量,计算本实验制备感受态的转化率(cfu/μg DNA)。

参考文献

1. 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京:高等教育出版社,1993. 287~289 2. 刘进元等. 分子生物学实验指导. 北京:清华大学出版社,2002. 22~25

3. Cohen SN, Chang ACY, Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: Genetic

transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1972,69:2110 4. 魏群.分子生物学实验指导.北京:高等教育出版社,1999.53~55

实验二 质粒的提取与琼脂糖凝胶电泳分析

【实验目的】

熟悉碱法提取质粒以及DNA的琼脂糖电泳分析的原理和方法。 【实验原理】

在碱性条件下,染色体DNA发生变性,共价闭合的质粒DNA仍为自然状态。当溶液调至中性且有高浓度的盐存在条件下,变性的染色体DNA交联成不溶性的网格结构,变性的染色体DNA与蛋白质发生共沉淀,而质粒DNA仍存在于上清液中,通过离心去除沉淀,溶液中的质粒DNA可被异丙醇沉淀。

DNA在碱性的电泳缓冲溶液中因带负电荷,电泳时向正极移动,不同DNA的电泳迁移率与其分子长度与形态有关,DNA分子越大,则迁移率越小,因此,通过电泳可将不同长度的DNA分子分开。 【器材与试剂】

1.实验仪器 细菌培养箱,控温摇床,高压灭菌锅,微量移液器,高速台式离心机,电泳仪,水平电泳槽,紫外分析仪,pH计,微波炉

2.实验试剂 琼脂粉,100 mg/mL 氨苄青霉素钠,氯仿,异丙醇,70% 乙醇,琼脂糖,溴化乙锭,20 μg/mL RNase A, LB液体培养基,溶液I:50 mmol/L葡萄糖,10 mmol/L EDTA, 25 mmol/L Tris-Cl缓冲溶液(pH8.0);溶液II:0.2 mol/L NaOH,1% SDS;溶液III: 3 mol/L 醋酸钾,5 mol/L 醋酸;TE缓冲溶液:10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0),1 mmol/L EDTA;TAE缓冲溶液(50×):2 mol/L Tris-乙酸,0.05 mol/L EDTA,pH8.0;载样缓冲溶液(10×):0.25% 溴酚蓝,30%甘油。

3.实验材料 转化pUC18的大肠杆菌(E.coli DH5α),λDNA/EcoR I, Hind III 【实验步骤】 一、质粒的提取

1.从平板上挑取转化pUC18的大肠杆菌的单菌落,接种于20 mL 含100 μg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中,37℃,振荡(250 r/min)培养过夜。

2.取1.2 mL培养物置于Eppendorf管中,10 000 rpm离心1min,弃上清。

3.沉淀菌体用0.1 mL溶液I重新悬浮,加入0.2 mL溶液II,颠倒数次至溶液变得澄清,最后加入0.15 mL溶液III,轻轻颠倒Eppendorf管数次,10 000 rpm离心10 min。

4.上清液移入一个新的Eppendorf管中,加入0.2 mL氯仿,快速颠倒数次,10 000 rpm离心10 min,将上清液移入另一个Eppendorf管中,加入等体积异丙醇,混匀,10 000 rpm离

心10 min,弃上清。

5.向管中加入0.5 mL 70%乙醇,10 000 rpm,离心2 min,弃上清,室温挥干酒精,加入20 μL 含20 μg/mL RNase A 的TE缓冲溶液溶解DNA。 二、琼脂糖凝胶电泳

1.称取1 g 琼脂糖,加入TAE缓冲溶液(1×)100 mL,微波炉加热熔化,配制 1%琼脂糖凝胶,稍微冷却后,倒入制胶模具,插好梳子,待胶凝固后,拔出梳子。

2.将凝胶连同制胶模具放入电泳槽,倒入TAE缓冲溶液(1×)使溶液没过胶面,取9 μL提取的质粒与1 μL栽样缓冲溶液混合,用微量移液器点加到凝胶的加样孔内。 3.80~100 V 电泳,当溴酚蓝移动到距凝胶下边沿约1cm处时,停止电泳。

4.将凝胶浸泡在含0.5 μg/mL溴化乙锭的TAE缓冲溶液(1×)中染色30 min,于紫外分析仪内观察结果。 【注意事项】

1. 质粒提取过程中,加入溶液II和溶液III后,要混匀,但动作要轻缓。 2. 质粒沉淀后,由于量比较少,贴在管壁上,在洗涤时不要将其移走。 【实验作业】

1. 说明溶液I、溶液II和溶液III的作用是什么? 2. 在琼脂糖凝胶上,哪一条带为超螺旋DNA?为什么?

参考文献

1. 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京:高等教育出版社,1993. 107~108 2.刘进元等. 分子生物学实验指导. 北京:清华大学出版社,2002. 1~10

实验三 重组DNA分子的构建

【实验目的】

熟悉DNA的酶切、片段回收、DNA连接、转化以及重组子的筛选的方法。 【实验原理】

DNA经限制性内切酶切割成大小不同的片段,电泳分离后,切胶回收目的片段,琼脂糖凝胶用高浓度的NaI溶液溶解后,玻璃奶(glass milk)可以吸附DNA,去除NaI后,用无菌水或TE缓冲溶液解吸附,获得DNA片段。回收的酶切质粒DNA与目的DNA片段,在T4 DNA连接酶的作用下进行连接,构建重组子,重组子转化大肠杆菌后,提取重组DNA分子进行酶切鉴定或利用其它方法如α-互补进行筛选。 【器材与试剂】

1.实验仪器 细菌培养箱,恒温摇床,超净工作台,台式离心机,水浴锅,高压灭菌锅,微量移液器,电泳仪,电泳槽,紫外分析仪

2.实验试剂 氯化钠(AR),蛋白胨,酵母提取物,氨苄青霉素钠,EcoR I, Hind III, 酶切缓冲液(买酶附赠),琼脂糖,TAE缓冲溶液(50×),玻璃奶(glass milk), NaI溶液(溶胶液): 称取NaI 90.8 g, Na2SO3 1.5 g,用无菌水溶解并定容至100 mL,4℃,避光保存;乙醇洗涤液:50 mL乙醇中含 20 mmol/L Tris-Cl (pH7.4), 1 mmol/L EDTA,0.1 mol/L NaCl, -20℃保存;灭菌双蒸水,T4 DNA连接酶,T4 DNA连接酶缓冲液(购酶附赠),载样缓冲溶液(10×),X-gal溶液:20 mg 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal) 溶于1 mL二甲基甲酰胺中;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)溶液:1 g IPTG 溶于4 mL双蒸水,定容至5 mL,微孔滤器除菌,-20℃保存

3.实验材料 E.coli DH5α, pUC18质粒,λDNA/EcoR I, Hind III 【实验步骤】 一、DNA的酶切

20 μL酶切体系含:2 μL 酶切缓冲液,5 μL pUC18质粒( 约2μg),1 μL EcoR I ,1 μL Hind III, 11 μL 无菌双蒸水。离心5 s, 混匀,37℃酶切30 min~1 h。 二、电泳分离

1. 配制1%的琼脂糖凝胶,方法同前一实验。

2. 20 μLλDNA/EcoR I, Hind III(约2 μg)和酶切体系中分别加入2 μL载样缓冲溶液(10×),混匀,分别加样,电泳,具体方法如前一实验。 2. 将凝胶在溴化乙锭染色液中染色30 min。