三、DNA回收

1．在紫外灯下将含线性pUC18质粒DNA和947 bp λDNA片段的凝胶分别切下置1.5 mL Eppendorf管中, 加入3倍于凝胶体积的NaI溶液溶解，50℃水浴溶胶，间或摇动，至凝胶完全溶解。

2．加入10 μL玻璃奶，混匀，室温放置5 min，8000 rpm离心1 min，弃上清。 3．沉淀用0.2 mL 的乙醇洗涤液悬浮，8000 rpm离心1 min，弃上清。 4．重复操作3

5. 将Eppendorf管开口于室温放置至玻璃粉变白，加入20 μL 无菌双蒸水悬浮，50℃水浴保温5 min。

6. 10 000 rpm离心5 min，分别取出上清置于一Eppendorf管。 四、DNA 连接

1．20 μL连接体系含：7 μL回收的pUC18质粒DNA，10 μL回收的λDNA片段，2 μL T4 DNA连接酶缓冲液，1 μL T4 DNA连接酶。 2． 12～16℃条件下，连接过夜。 五、转化

１．配制LB液体和固体培养基，方法同前。制备含100 μg/mL氨苄青霉素钠的LB培养基固体平板，将20 μL X-gal 和4 μL IPTG均匀涂布在每一平板表面，37℃，放置1 h。 ２. 取10 μL连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，取200 μL转化产物涂布在平板上，37℃培养过夜，观察菌落数量和颜色。 【注意事项】

1． 溶胶的时候，一定要使凝胶溶解彻底，以免连接产物在12～16℃条件下重新凝固。 2． 操作过程中乙醇洗涤液一定要挥发干净，否则影响随后的连接反应。 【实验作业】

1． 如果实验过程中进行的是单酶切，如何防止质粒的自身连接？

2． 利用α-互补进行阳性克隆筛选的原理是什么？白色菌落含有重组子，还是蓝色菌落含有

重组子？

参考文献

1. 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社，1993. 131, 300 2．刘进元等. 分子生物学实验指导. 北京：清华大学出版社，2002. 11~21 3. 朱玉贤，李毅. 现代分子生物学（第二版）. 北京：高等教育出版社，2002. 153

实验四 聚合酶链式反应扩增DNA

【实验目的】

熟悉通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，简称PCR）体外扩增特定DNA片段的技术原理和实验方法。 【实验原理】

PCR是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促DNA合成反应。反应分为三步：（1）变性（denaturation）: 双链DNA在高温条件下解开成单链；（2）退火（annealing）:当温度降低时，引物与单链模板DNA 的特定序列结合；（3）延伸（extension）: DNA聚合酶以单链DNA为模板，按照碱基互补配对原则，从引物的3’端按照5’→3’方向合成新链。以上述三步为一个循环，每个循环合成的DNA都可作为下一个循环的模板，经过多个循环后，特定的DNA片段数量可以增加到2倍。 本实验根据噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）基因组中的crtE序列（crtE编码牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶，参与类胡萝卜素的合成），设计一对引物，从基因组中扩增该基因。

【器材与试剂】

1．实验仪器 PCR仪，微量移液器，电泳仪，DNA电泳槽，紫外分析仪

2．实验试剂 Taq DNA聚合酶，PCR缓冲溶液（10×），10 mmol/L dNTP 混合液，λDNA/EcoR I, Hind III，琼脂糖，DNA载样缓冲溶液(（10×），溴化乙锭染色液，TAE缓冲溶液（50×）

3． 实验材料 噬夏孢欧文氏菌基因组DNA，PCR专用薄壁管 引物1：5’-GAATTCCATATGACGGTCTGCGCAAAAAAAC-3’ 引物2：5’-ATTCTCGAGTTAACTGACGGCAG-3’

【实验步骤】

1．在0.2 mL的PCR薄壁管中加入下列组分配成20 μL反应体系：2 μL PCR缓冲溶液（10×），1 μL引物1（0.5 μmol/L），1 μL引物2（0.5 μmol/L），1 μL dNTP 混合液，1 μL Taq DNA 聚合酶，1 μL噬夏孢欧文氏菌基因组DNA（约10 ng），13 μL 无菌双蒸水。

2．PCR参数设为：94℃预变性5 min，94℃变性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸1 min，共进行35个循环，最后72℃保温10 min。

n

3．用1×TAE配制1%琼脂糖凝胶。

4． 在PCR反应体系中加入2 μL载样缓冲溶液，混合后，上样电泳。 5． 将凝胶用溴化乙锭染色30 min，于紫外分析仪内观察结果。 【注意事项】

1．本实验PCR反应体系应充分混合均匀。

2．应根据选购Taq DNA 聚合酶公司提供的使用说明，选择合适的PCR缓冲溶液，有的缓冲液中添加了Mg2+，有的则没有。 【实验作业】

影响PCR扩增产物特异性的因素有哪些？

参考文献

1. 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社，1993. 408～417

2．Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. Short protocols in molecular Biology( 3rd ed.). John Wiley & Sons, Inc. 1995. 15-1

3. 汪靖超，孙东平，杜桂彩等. 噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）类胡萝卜素合成相关基因crtE的克隆及其在大肠杆菌中的表达. 食品科学，2007，28（7）：276～279

实验五 植物基因组DNA的制备与纯度分析

【实验目的】

熟悉植物基因组DNA的提取及其纯度的鉴定方法。 【实验原理】

植物材料经过液氮粉碎，提取液中阳离子型去垢剂十六烷基三甲基溴化铵(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide，简称为CTAB)能溶解细胞膜和核膜，解聚核蛋白，且与DNA形成复合物，在高盐条件下，该复合物是可溶的。用氯仿等有机溶剂抽提，可使蛋白质变性，使多糖沉淀，经过离心， CTAB-DNA复合物仍保留在上清液中，降低盐浓度，则CTAB-DNA复合物发生沉淀，沉淀用高盐TE缓冲溶液溶解后，加入异丙醇，CTAB仍在溶液中，但DNA发生沉淀，沉淀溶于TE缓冲溶液中，即得植物基因组DNA。

DNA纯度分析常用的方法有琼脂糖凝胶电泳分析法和紫外分光光度法两种。纯净的DNA溶液是透明的，用紫外分光光度计测定其在260 nm和280 nm处的吸光度，OD260/OD280值约为1.8，若二者比值大于1.8，表明样品中含有较多的RNA，若比值小于1.6，则说明样品中含有较多的蛋白质或酚类等杂质。 【器材与试剂】

1．实验仪器 台式高速冷冻离心机，微量移液器，水浴锅，液氮罐，陶瓷研钵，紫外分光光度计，高压灭菌锅

2．实验试剂 β-巯基乙醇，乙醇，异丙醇，CTAB提取液：2% CTAB，0.1 mol/L Tris-Cl,pH8.0，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，20 μg/mL RNase A ，室温保存；CTAB/NaCl溶液：4.1 g NaCl溶解于80 mL蒸馏水，缓缓加入10 g CTAB， 边加热边搅拌至溶解，用蒸馏水定容至100 mL；CTAB沉淀溶液：1% CTAB，50 mmol/L Tris-Cl,pH8.0，10 mmol/L EDTA，pH8.0, 室温保存；氯仿/异戊醇（24：1，v/v）：按24:1的体积比配制，4℃保存；高盐TE缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl,pH8.0，0.1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl，高温灭菌后室温保存；TE缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl, 1 mmol/L EDTA，pH8.0，高温灭菌后室温保存。 3．实验材料 新鲜的烟草叶片 【实验步骤】

1．向一定量的CTAB提取液中加入β-巯基乙醇至终浓度为2%（v/v），并在水浴锅中将溶液升温到65℃。

2．称取1 g烟草叶片，放在用液氮预冷的研钵内, 倒入液氮迅速研磨成粉末，转入无菌的

离心管。

3． 加入 4 mL预热到65℃的CTAB提取液，混匀，65℃水浴中保温10～60 min，间或摇动。 4. 向上述离心管中加入4 mL氯仿/异戊醇，颠倒离心管数次，4 ℃，10 000 ×g离心10 min，取上清转移到另一个离心管中。

5. 向上清中加入1/10体积预热到65℃的CTAB/NaCl溶液，颠倒离心管数次。然后加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管数次，室温条件下，10 000×g离心10 min，取上清转移到一个新离心管中。

6．向上清液中加入2倍体积的CTAB沉淀溶液，颠倒离心管数次，室温条件下，10 000×g离心5 min，弃上清。

7．沉淀用0.5 mL高盐TE缓冲液溶解,然后转移到一无菌Eppendorf管中。若沉淀难于溶解，则可将离心管放在65℃水浴中处理30 min。

8．向盛有DNA溶液的Eppendorf管中加入0.6 mL的异丙醇，混匀，4 ℃，10 000×g离心15 min，弃上清。

9．沉淀用0.5 mL 80%乙醇润洗一次，室温干燥，加入0.1 mL TE缓冲液溶解沉淀，得DNA溶液。

10．取5 μL DNA溶液加无菌水至4 mL，放入石英比色皿，用紫外分光光度计测定其在260 nm和280 nm处的吸光度，计算OD260/OD280，判断所提取DNA的纯度。 【注意事项】

1． 实验时应尽量选用酚含量较低植物的幼嫩组织。

2． 若加入CTAB沉淀溶液后无沉淀析出，表明盐浓度较高，应用CTAB沉淀溶液继续稀释。 【实验作业】

1．影响所提取DNA质量的因素有哪些？

2．依据该方法提取的DNA在基础研究领域有何应用？

参考文献

1.王关林，方宏筠.植物基因工程原理与技术.北京：科学出版社，1998，370～375 2．Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. Short protocols in molecular Biology( 3rd ed.). John Wiley & Sons, Inc. 1995. 2-10