分子生物学常规实验方法 下载本文

荡培养(250 r/min)3 h,加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,继续培养4h。 4. 培养物在4℃,5 000×g离心10 min,收集菌体。

5. 菌体重新悬浮于冰冷的20 mL结合缓冲溶液中,冰浴条件下用超声波破碎细胞15次(800W,工作时间10 s,间隔时间60 s)。

6.细胞裂解液于4℃,12 000×g离心30 min,取上清液,保留50 μL以备电泳分析。 7.将其余上清液加到层析柱内,让其自然流过层析介质。

8.先用10 mL结合缓冲液冲洗层析柱,再用8 mL洗涤缓冲液洗涤层析柱。 9.用4 mL洗脱缓冲液洗脱目的蛋白,收集洗脱液。

10.分别取10 μL细胞裂解液、洗脱液与10 μL蛋白载样缓冲液(2×)混合,煮沸5 min,SDS-PAGE分析,观察纯化效果。 【注意事项】

层析过程中所使用的溶液不应含有EDTA、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇等能敖合金属离子的试剂,以免将树脂上的Ni洗掉,导致无法纯化出蛋白。 【实验作业】

1. 除了超声波细胞破碎法以外,常用的细胞破碎还有哪些方法,比较这些方法的优缺点。 2. 如何有效降低蛋白质纯化过程中发生的降解?

参考文献

1. User protocol for His.Bind Kits,Novagen,USA.

2. 汪靖超,孙东平,杜桂彩等. 噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)类胡萝卜素合成相关基因crtE的克隆及其在大肠杆菌中的表达. 食品科学,2007,28(7):276~279

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实验九 重组蛋白的Dot-Western blot 分析

【实验目的】

熟悉利用Dot-Western blot进行微量重组蛋白鉴定分析的原理和方法。 【实验原理】

微量重组蛋白(纯化或未纯化的)固定在硝酸纤维素(NC)膜上以后,用脱脂奶粉封闭NC膜上其他结合位点,利用兔抗重组蛋白的抗体(一抗)可特异与重组蛋白结合的特点,当NC膜与一抗溶液温育时,抗体可特异结合在重组蛋白上,当NC膜再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG的抗体(二抗兔)溶液温育时,则该抗体可特异的与一抗结合,将NC膜浸泡在含辣根过氧化物酶底物的溶液中,HRP与二氨基联苯胺(DAB)及H2O2反应生成褐色产物,沉淀于NC膜上重组蛋白所在部位,故可以检测目的蛋白的存在。 【器材与试剂】

1.实验仪器 微量移液器,脱色摇床

2.实验试剂 封闭液:5%脱脂奶粉,150 mmol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-Cl,pH7.5;漂洗液:150 mmol/L,NaCl 20 mmol/L Tris-Cl,pH7.5;显色液:20 mmol/LTris-Cl,pH8.0,0.1% NiCl2 ,0.01% H2O2 ,0.01% 3,3’二氨基联苯胺(DAB)

3.实验材料 1 mg/mL重组牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶,1 mg/mL牛血清白蛋白,兔抗牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶抗血清,羊抗兔IgG的抗体 【实验步骤】

1.分别取重组牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶和牛血清白蛋白(阴性对照)溶液各2 μL点在NC膜上的两处,用铅笔标记。

2.将NC膜放在一个干净培养皿中,加入20 mL封闭液于脱色摇床上温育1 h。

3.加入10 μL兔抗牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶抗血清(按照抗体效价调整一抗加入量),混匀,继续摇动2 h。

4.弃封闭液, NC膜分别用10 mL漂洗液洗膜3次,每次10 min。

5.弃漂洗液,重新加入20 mL封闭液和10 μL HRP标记的羊抗兔IgG,混匀,于脱色摇床上温育1 h。

6.弃封闭液,NC膜分别用10 mL漂洗液洗膜3次,每次10 min。

7.将NC膜转移到一个干净培养皿,加入20 mL显色液显色,待斑点清晰后,弃显色液。 8.将NC膜浸于蒸馏水中终止反应。 【注意事项】

如果待检测的目的蛋白是牛奶中的某一组分,则不能使用脱脂奶粉作为封闭剂。 【实验作业】

如何提高Dot-Western blot分析的特异性和灵敏度? 参考文献

1.Makkouk KM,Hsu HT,Kumari SG. Detection of three plant viruses by dot-blot and tissue-blot immunoassays using chemiluminescent and chromogenic substrates. Journal of Phytopathology, 2008,139:97~102

2.Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. Short protocols in molecular Biology( 3 ed.). John Wiley & Sons, Inc. 1995. 10-47

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实验十 叶绿体DNA的制备

【实验目的】

熟悉植物叶绿体DNA的制备方法。 【实验原理】

叶绿体是绿色植物特有的进行光合作用的细胞器,内有环状双链的叶绿体DNA,在植物的能量代谢和物质代谢过程中发挥着重要的作用,如叶绿素与类胡萝卜素的合成等。绿色植物的叶片经过匀浆、过滤、离心获得叶绿体,叶绿体被SDS和蛋白酶K裂解释放DNA,裂解液经氯仿/异戊醇抽提去除蛋白等杂质,溶液中的DNA可被乙醇沉淀。 【器材与试剂】

1. 实验仪器 研钵,冷冻离心机,电泳仪,水平电泳槽,移液器

2. 实验试剂 提取液:50 mmol/L Tris-Cl,pH8.0, 0.4 mol/L蔗糖,10 mmol/L NaCl,5 mmol/L EDTA,2 mmol/L β-巯基乙醇;悬浮液:50 mmol/L Tris-Cl,pH8.0,150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA;裂解液:4% SDS, 1 mg/mL蛋白酶K(用悬浮液配制);氯仿/异戊醇(24:1,v/v),异丙醇,70%乙醇,琼脂糖,TE缓冲溶液:10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0),1 mmol/L EDTA;DNA载样缓冲溶液((10×),溴化乙锭染色液,TAE缓冲溶液(50×),λDNA/EcoR I, Hind III 3.实验材料 新鲜菠菜叶片 【实验步骤】

1. 叶绿体的提取 称取新鲜菠菜叶片10 g 放入研钵中,加10 mL 冰冷的提取液和少许石英沙,冰浴研磨成匀浆,再加入10 mL提取液,用4层纱布将匀浆过滤于一离心管中,4℃,700×g离心5 min,将上清液转移到另一离心管中,4℃,2 000×g离心10 min,弃上清,沉淀即为叶绿体。

2. 叶绿体DNA的提取 沉淀用5 mL悬浮液重新悬浮,加入等体积的裂解液,混匀,37℃保温2 h,加入10 mL氯仿/异戊醇,颠倒离心管数次,4℃,12 000×g离心10 min,取上清,加入1/10体积的醋酸钠溶液和等体积的异丙醇,混匀,-20℃放置2 h,4℃,12 000×g离心10 min,取沉淀,用70%乙醇润洗后,室温干燥。

3.叶绿体DNA的电泳分析 加入100 μL TE 缓冲溶液溶解沉淀,取9 μL DNA溶液和1μL DNA载样缓冲溶液混合,连同λDNA/EcoR I, Hind III一起进行琼脂糖凝胶电泳分析,观察实验结果。 【注意事项】

叶绿体提取时应控制好离心的转速和离心时间,否则可能影响到所提叶绿体的纯度,从

而影响最终所提叶绿体DNA的纯度。 【实验作业】

1.叶绿体DNA有哪些特点?它与细菌的染色体DNA有哪些相似之处? 2. 叶绿体DNA在基础研究方面有哪些用途?

参考文献

1.张志良,瞿伟青. 植物生理学实验指导(第三版). 北京:高等教育出版社,2003.87 2. 史公军,侯喜林,王彦华. 白菜叶绿体DNA的快速提取及分析.应用与环境生物学报,2005,11(3):283~285

3.梁明山,陈斌,吴书惠. 油菜叶绿体DNA的提取和纯化.中国油料,1995,17(2):57~58