荡培养（250 r/min）3 h，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续培养4h。 4. 培养物在4℃，5 000×g离心10 min，收集菌体。

5． 菌体重新悬浮于冰冷的20 mL结合缓冲溶液中，冰浴条件下用超声波破碎细胞15次（800W,工作时间10 s，间隔时间60 s）。

6．细胞裂解液于4℃，12 000×g离心30 min，取上清液，保留50 μL以备电泳分析。 7．将其余上清液加到层析柱内，让其自然流过层析介质。

8．先用10 mL结合缓冲液冲洗层析柱，再用8 mL洗涤缓冲液洗涤层析柱。 9．用4 mL洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱液。

10．分别取10 μL细胞裂解液、洗脱液与10 μL蛋白载样缓冲液（2×）混合，煮沸5 min，SDS-PAGE分析，观察纯化效果。 【注意事项】

层析过程中所使用的溶液不应含有EDTA、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇等能敖合金属离子的试剂，以免将树脂上的Ni洗掉，导致无法纯化出蛋白。 【实验作业】

1． 除了超声波细胞破碎法以外，常用的细胞破碎还有哪些方法，比较这些方法的优缺点。 2． 如何有效降低蛋白质纯化过程中发生的降解？

参考文献

1． User protocol for His.Bind Kits，Novagen，USA.

2. 汪靖超，孙东平，杜桂彩等. 噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）类胡萝卜素合成相关基因crtE的克隆及其在大肠杆菌中的表达. 食品科学，2007，28（7）：276～279

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实验九 重组蛋白的Dot-Western blot 分析

【实验目的】

熟悉利用Dot-Western blot进行微量重组蛋白鉴定分析的原理和方法。 【实验原理】

微量重组蛋白（纯化或未纯化的）固定在硝酸纤维素（NC）膜上以后，用脱脂奶粉封闭NC膜上其他结合位点，利用兔抗重组蛋白的抗体（一抗）可特异与重组蛋白结合的特点，当NC膜与一抗溶液温育时，抗体可特异结合在重组蛋白上，当NC膜再与辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG的抗体（二抗兔）溶液温育时，则该抗体可特异的与一抗结合，将NC膜浸泡在含辣根过氧化物酶底物的溶液中，HRP与二氨基联苯胺（DAB）及H2O2反应生成褐色产物，沉淀于NC膜上重组蛋白所在部位，故可以检测目的蛋白的存在。 【器材与试剂】

1．实验仪器 微量移液器，脱色摇床

2．实验试剂 封闭液：5%脱脂奶粉，150 mmol/L NaCl， 20 mmol/L Tris-Cl，pH7.5；漂洗液：150 mmol/L，NaCl 20 mmol/L Tris-Cl，pH7.5；显色液：20 mmol/LTris-Cl,pH8.0，0.1% NiCl2 ，0.01% H2O2 ，0.01% 3,3’二氨基联苯胺（DAB）

3．实验材料 1 mg/mL重组牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶，1 mg/mL牛血清白蛋白，兔抗牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶抗血清，羊抗兔IgG的抗体 【实验步骤】

1．分别取重组牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶和牛血清白蛋白（阴性对照）溶液各2 μL点在NC膜上的两处，用铅笔标记。

2．将NC膜放在一个干净培养皿中，加入20 mL封闭液于脱色摇床上温育1 h。

3．加入10 μL兔抗牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶抗血清（按照抗体效价调整一抗加入量），混匀，继续摇动2 h。

4．弃封闭液， NC膜分别用10 mL漂洗液洗膜3次，每次10 min。

5．弃漂洗液，重新加入20 mL封闭液和10 μL HRP标记的羊抗兔IgG，混匀，于脱色摇床上温育1 h。

6．弃封闭液，NC膜分别用10 mL漂洗液洗膜3次，每次10 min。

7．将NC膜转移到一个干净培养皿，加入20 mL显色液显色,待斑点清晰后，弃显色液。 8．将NC膜浸于蒸馏水中终止反应。 【注意事项】

如果待检测的目的蛋白是牛奶中的某一组分，则不能使用脱脂奶粉作为封闭剂。 【实验作业】

如何提高Dot-Western blot分析的特异性和灵敏度？ 参考文献

1．Makkouk KM，Hsu HT，Kumari SG. Detection of three plant viruses by dot-blot and tissue-blot immunoassays using chemiluminescent and chromogenic substrates. Journal of Phytopathology, 2008,139:97～102

２．Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. Short protocols in molecular Biology( 3 ed.). John Wiley & Sons, Inc. 1995. 10-47

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实验十 叶绿体DNA的制备

【实验目的】

熟悉植物叶绿体DNA的制备方法。 【实验原理】

叶绿体是绿色植物特有的进行光合作用的细胞器，内有环状双链的叶绿体DNA，在植物的能量代谢和物质代谢过程中发挥着重要的作用，如叶绿素与类胡萝卜素的合成等。绿色植物的叶片经过匀浆、过滤、离心获得叶绿体，叶绿体被SDS和蛋白酶K裂解释放DNA，裂解液经氯仿/异戊醇抽提去除蛋白等杂质，溶液中的DNA可被乙醇沉淀。 【器材与试剂】

1． 实验仪器 研钵，冷冻离心机，电泳仪，水平电泳槽，移液器

2. 实验试剂 提取液：50 mmol/L Tris-Cl,pH8.0, 0.4 mol/L蔗糖，10 mmol/L NaCl,5 mmol/L EDTA,2 mmol/L β-巯基乙醇；悬浮液：50 mmol/L Tris-Cl,pH8.0，150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA；裂解液：4% SDS, 1 mg/mL蛋白酶K(用悬浮液配制)；氯仿/异戊醇（24：1，v/v），异丙醇，70%乙醇，琼脂糖，TE缓冲溶液：10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0),1 mmol/L EDTA；DNA载样缓冲溶液(（10×），溴化乙锭染色液，TAE缓冲溶液（50×），λDNA/EcoR I, Hind III 3．实验材料 新鲜菠菜叶片 【实验步骤】

1. 叶绿体的提取 称取新鲜菠菜叶片10 g 放入研钵中，加10 mL 冰冷的提取液和少许石英沙，冰浴研磨成匀浆，再加入10 mL提取液，用4层纱布将匀浆过滤于一离心管中，4℃，700×g离心5 min，将上清液转移到另一离心管中，4℃，2 000×g离心10 min，弃上清，沉淀即为叶绿体。

2. 叶绿体DNA的提取 沉淀用5 mL悬浮液重新悬浮，加入等体积的裂解液，混匀，37℃保温2 h，加入10 mL氯仿/异戊醇,颠倒离心管数次，4℃，12 000×g离心10 min，取上清，加入1/10体积的醋酸钠溶液和等体积的异丙醇，混匀，-20℃放置2 h，4℃，12 000×g离心10 min，取沉淀，用70%乙醇润洗后，室温干燥。

3．叶绿体DNA的电泳分析 加入100 μL TE 缓冲溶液溶解沉淀，取9 μL DNA溶液和1μL DNA载样缓冲溶液混合，连同λDNA/EcoR I, Hind III一起进行琼脂糖凝胶电泳分析，观察实验结果。 【注意事项】

叶绿体提取时应控制好离心的转速和离心时间，否则可能影响到所提叶绿体的纯度，从

而影响最终所提叶绿体DNA的纯度。 【实验作业】

1．叶绿体DNA有哪些特点？它与细菌的染色体DNA有哪些相似之处？ 2． 叶绿体DNA在基础研究方面有哪些用途？

参考文献

1．张志良，瞿伟青. 植物生理学实验指导（第三版）. 北京：高等教育出版社，2003.87 2. 史公军，侯喜林，王彦华. 白菜叶绿体DNA的快速提取及分析.应用与环境生物学报，2005，11（3）：283～285

3．梁明山，陈斌，吴书惠. 油菜叶绿体DNA的提取和纯化.中国油料，1995，17（2）：57～58